2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K11309
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
北村 信隆 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任教授 (90224972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芳澤 享子 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (60303137)
中田 光 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (80207802)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | mTOR阻害剤 / 口内炎 / 発症機序 / ヒト口腔粘膜上皮細胞培養 / シロリムス / リンパ脈管筋腫症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mTOR 阻害剤（分子標的薬）のシロリムスは、若年女性の希少難病であるリンパ脈管筋腫症（略称LAM）の治療薬（中田ら、New Engl.J.Med. 2011）として、申請者らを中心に医師主導治験が行われ、2014年、世界で初めて薬事承認された。高頻度に発症する有害事象の一つに口内炎がある。それによりしばしば摂食・嚥下や会話等の機能が低下することがあり、投薬の減量や中止を余儀なくされることもある。しかしmTOR 阻害剤による口内炎の発症機序は不明であり、有効な予防法も確立されていない。
そこでまず、シロリムスによる口内炎発症の臨床的研究として、2012年6月から2014年7月までの2年間にシロリムスが投与された63例を対象として、口内炎の発症状況ならびにそのリスクファクターに関する分析を行った。その結果、63例中、56例（88.9％）に口内炎が発症した。口内炎に関するリスクファクター分析により、服薬時のヘモグロビン濃度が低い症例ほど、口内炎の累積発症率が高かった。さらに、シロリムスの投与後、貧血のタイプの指標であるMCV（平均赤血球容積）とMCH（平均赤血球ヘモグロビン量）が経時的に急速に減少したが、その際、最初の3ヵ月でのMCVならびにMCHの減少量が大きい症例ほど、口内炎の累積発症率が高かった。
さらに口内炎に関するin vitroでの基礎的研究として、2名の患者から採取した口腔粘膜細胞を7継代から8継代まで細胞培養した。次いで同培養細胞上にシロリムスを添加し、培養細胞の反応を観察した。その結果、一部の細胞の小型化ならびに細胞死の所見が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画１．mTOR阻害剤（テムシロリムス、エベロリムス、シロリムス）のヒト口腔粘膜上皮細胞増殖能に及ぼす影響の評価（in vitro の検索）
１）ヒト口腔粘膜上皮細胞の培養:新潟大学歯学部倫理委員会の承認のもと、同意の得られた患者より口腔粘膜を採取し、従来の無血清培地（EpiLife®）の存在下で口腔粘膜上皮細胞を培養した。２）シロリムス添加培地による口腔粘膜上皮細胞の培養。３）細胞増殖能分析:リンパ脈管筋腫症におけるシロリムス有効トラフ血中濃度は、5-15ng/mlとされているが、これは、5-15 nMにあたる。ほとんどは、赤血球中に分布しているので、実際に患者の血漿中のシロリムス濃度は、数十pMと思われる。口腔粘膜細胞（８から９継代したもの）を無血清培地中で培養し、そこにシロリムスを添加して、４日目に生残率をMTTアッセイで調べたところ、IC５０は、およそ0.2 pMであった。４）形態的検索:細胞形態については位相差顕微鏡下で観察した。口腔粘膜細胞は、楕円形から紡錘形の付着細胞であるが、シロリムス存在下では小型紡錘形細胞の割合が増加した。光学顕微鏡下で観察、画像化した。５）表面抗原検索:シロリムス存在下および非存在下で培養した口腔粘膜細胞のAnexinⅤの発現を調べたところ、シロリムスの濃度が高くなるにつれ、発現が上昇した。シロリムス濃度の増加により、細胞死の割合が高くなると思われる。
計画２．mTOR 阻害剤（シロリムス）の培養口腔粘膜上皮増殖能、分化能に及ぼす影響の評価
１）形態学的検索、２）免疫組織化学的検索
以上の実験により、薬剤による口腔粘膜上皮細胞増殖の抑制を確認し得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度までの検討で、シロリムスは、口腔粘膜細胞の in vitroにおける増殖を抑制することがわかったため、28年度は以下のことを明らかにしていきたい。
a）同種同効薬であるエベロリムス、テムシロリムスの口腔粘膜細胞に対する増殖抑制効果をin vitroで検討し、IC50を求める。
b）シロリムスによる増殖抑制がトランスフェリンリセプターを介した鉄吸収が阻害されている可能性があるので、これをin vitroで調べていく。
c）シロリムスによる口腔粘膜細胞の増殖抑制がデキサメサゾンやビタミンB2の添加により解除されるかどうかをin vitroで調べていく。
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| Causes of Carryover |
当初27年度ではヒト口腔粘膜上皮細胞を培養して口腔粘膜シート（EVPOME）を作製し、mTOR阻害剤であるテムシロリムス、エベロリムス、シロリムスのヒト口腔粘膜上皮細胞増殖能に及ぼす影響を評価する予定であったが、臨床研究においてシロリムスによる口内炎発症に関する分析が行われたため、計画を変更し、ヒト口腔粘膜上皮細胞を培養し、まずシロリムスのヒト口腔粘膜上皮細胞増殖能に及ぼす影響を評価することとした。同種同効薬であるテムシロリムスならびにエベロリムスのヒト口腔粘膜細胞に対する増殖抑制効果のin vitroでの検討ならびにIC50の測定を次年度に行うこととし、未使用額は当該実験等に関わる下記の経費に充てることとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
・口腔粘膜の培地を購入する（サプリメントと合わせて500mlで約40,000円）し、培養して重層化した細胞シートの病理標本を作製する。
・オールインワン顕微鏡で細胞表面抗原を観察するため、蛍光フィルターや蛍光ラベル抗体を購入する。
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