mTOR阻害剤による口内炎の発症機序の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11309
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 北村 信隆 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任教授 (90224972)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 芳澤 享子 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (60303137) ; 中田 光 新潟大学, 医歯学総合病院, 教授 (80207802) ; 武井 延之 新潟大学, 脳研究所, 准教授 (70221372)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: mTOR阻害剤 / 有害事象 / 口内炎 / 発症機序 / ヒト口腔粘膜上皮細胞培養 / シロリムス

Outline of Annual Research Achievements

mTOR 阻害剤のシロリムスは、若年女性の希少難病であるリンパ脈管筋腫症の治療薬として、2014年、世界で初めて薬事承認された。高頻度に発症する有害事象の一つに口内炎がある。それによりしばしば摂食・嚥下や会話等の機能が低下することがあり、投薬の減量や中止を余儀なくされることもある。しかしmTOR 阻害剤による口内炎の発症機序は不明であり、有効な予防法も確立されていない。
シロリムスが投与された63例を対象として、口内炎の発症状況ならびにそのリスクファクターに関する分析を行った。その結果、63例中、56例（88.9％）に口内炎が発症した。服薬時のヘモグロビン濃度が低い症例ほど、口内炎の累積発症率が有意に高かった。シロリムスの投与後、貧血のタイプの指標であるMCV（平均赤血球容積）とMCH（平均赤血球ヘモグロビン量）が経時的に急速に減少した。その際、最初の3ヵ月でのMCVならびにMCHの減少量が大きい症例ほど、口内炎の累積発症率が有意に高かった。それらの新知見については現在投稿準備中である。
口内炎に関するin vitroでの基礎的研究として、2名の口腔粘膜細胞を7継代から8継代まで細胞培養し、有効血中濃度と同等の濃度（5～15ng/ml）でシロリムスを添加し、培養細胞への影響を観察した。その結果、細胞の小型化ならびに成長阻害が認められた。さらに細胞成長に関わる鉄イオンの影響を調べるため、鉄キレーターであるDeferoxamine の添加したところ、口腔粘膜の細胞数は濃度依存的に成長阻害を受けた。またシロリムス添加との相加作用も認められた。以上の結果はシロリムスの慢性投与が鉄代謝阻害の双方を介して口腔粘膜細胞の成長を阻害していることを示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

mTOR阻害剤（シロリムス）のヒト口腔粘膜上皮細胞の増殖能に及ぼす影響の評価（in vitro の検索）：１）ヒト口腔粘膜上皮細胞の培養　新潟大学歯学部倫理委員会の承認のもと、同意の得られた患者より口腔粘膜を採取し、無血清培地（EpiLife®）の存在下で口腔粘膜上皮細胞を培養した。２）シロリムスならびに鉄キレーター添加培地による口腔粘膜上皮細胞の培養　３）細胞増殖能分析　４）形態的検索
以上の実験により、シロリムスならびに鉄キレーターによる口腔粘膜上皮細胞増殖の抑制を確認し得た。

Strategy for Future Research Activity

1．シロリムスの存在下で口腔粘膜細胞が成長阻害を起こすのは、鉄イオンの利用障害によるものと考えている。トランスフェリン受容体の発現阻害や鉄トランスポーターの機能障害を解析する。
2．シロリムスによる口腔粘膜障害の機構には、細胞増殖の抑制と、細胞の成長障害、細胞死等のメカニズムが考えられる。増殖制御に関してはBrdUの取込みや細胞周期マーカー蛋白の免疫染色などで解析する。また細胞死はTUNNEL法やcleaved caspase3のイムノブロットなどで同定する。
以上の実験からシロリムスの代表的副作用である口内炎の発症メカニズムに迫りたい。

Causes of Carryover

臨床研究においてシロリムスによる口内炎発症に関するリスクファクター分析が行われ、シロリムスの直接作用の他に、鉄の取り込みに関する要因が示唆されたため、研究計画を変更した。また研究分担者の一人が移動し、研究分担者の変更手続きを行った。

Expenditure Plan for Carryover Budget

・口腔粘膜の培地を購入する（サプリメントと合わせて500mlで約40,000円）し、培養して重層化した細胞シートの病理標本を作製する。オールインワン顕微鏡で細胞表面抗原を観察するため、蛍光フィルターや蛍光ラベル抗体を購入する。
・シグナル伝達系の解明やトランスフェリン受容体、鉄トランスポーターの発現等を解析する。増殖制御に関してはBrdUの取込みや細胞周期マーカー蛋白の免疫染色などで解析し、細胞死はTUNNEL法やcleaved caspase3のイムノブロットなどで同定する。

Research Products

• [Journal Article] Efficacy and Safety of Long-Term Sirolimus Therapy for Asian Patients with Lymphangioleiomyomatosis. (2016)
  • Author(s): Takada T, Mikami A, Kitamura N, Seyama K, Inoue Y, Nagai K, Suzuki M, Moriyama H, Akasaka K, Tazawa R, Hirai T, Mishima M, Hayashida M, Hirose M, Sugimoto C, Arai T, Hattori N, Watanabe K, Tamada T, Yoshizawa H, Akazawa K, Tanaka T, Yagi K, Young LR, McCormack FX, Nakata K
  • Journal Title: Annals of the American Thoracic Society Volume: 13 Pages: 1912-1922
  • DOI: 10.1513/AnnalsATS.201605-335OC
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Megalin-Mediated Tubuloglomerular Alterations in High-Fat Diet-Induced Kidney Disease. (2016)
  • Author(s): Kuwahara S, Hosojima M, Kaneko R, Aoki H, Nakano D, Sasagawa T, Kabasawa H, Kaseda R, Yasukawa R, Ishikawa T, Suzuki A, Sato H, Kageyama S, Tanaka T, Kitamura N, Narita I, Komatsu M, Nishiyama A, Saito A.
  • Journal Title: Journal of the American Society of Nephrology. Volume: 27 Pages: 1996-2008
  • DOI: 10.1681/ASN.2015020190
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] シロリムスによる副作用対策 口内炎の管理について (2016)
  • Author(s): 北村信隆
  • Organizer: リンパ脈管筋腫症Web 講演会
  • Place of Presentation: Jストリーム 六本木スタジオ（東京都港区）
  • Year and Date: 2016-07-21
  • Invited
• [Presentation] Early and Late Onset Adverse Events in LAM Patients Treated with Sirolimus for Two Years (2016)
  • Author(s): Nakata K, Inoue Y, Seyama K, Tazawa R, Tamada T, Mikami A, Nakayama H, Suzuki M, Ebina M, Hanaoka M , Hattori N, Hirai T, Arai T, Sugimoto C, Kitamura N, Tanaka T, Akazawa K, Mishima M
  • Organizer: ATS 2016
  • Place of Presentation: San Francisco(USA)
  • Year and Date: 2016-05-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Early Intervention with Sirolimus Benefits Mild Lymphangioleiomyomatosis-Related Lung Disease (2016)
  • Author(s): Takada T, Seyama K, Inoue Y, Nagai K, Suzuki M, Moriyama H, Akasaka K, Tazawa R, Hirai T, Mishima M, Hayashida M, Hirose M, Sugimoto C, Arai T, Hattori N, Watanabe K, Mikami A, Tamada T, Yoshizawa H, Akazawa K, Tanaka T, Kitamura N, Nakata K
  • Organizer: ATS 2016
  • Place of Presentation: San Francisco(USA)
  • Year and Date: 2016-05-17
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] リンパ脈管筋腫症Web講演会 シロリムスによる副作用対策 口内炎の管理について
  • URL: https://nobelpark.jp/member/Rapalimus/guide/