2016 Fiscal Year Research-status Report
新たなシェーグレン症候群疾病因子の解明に向けた唾液腺の病態特異的タンパク質の解析
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15K11327
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
梨田 智子 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (10133464)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
下村 淳子 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (00386286)
水橋 史 (高橋史) 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 准教授 (60386266)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 耳下腺 / NODマウス / BPIFB1 / タンパク質の発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度はNODマウス耳下腺においてBpifb1遺伝子の発現が著しく上昇することを証明したが，タンパク質(BPIFB1)の発現上昇を報告していなかったので，平成28年度はBPIFB1発現証明のための実験を行い，論文にまとめて投稿した。
NODマウス耳下腺腺房細胞において，BPIFB1の発現はC57BL6マウスと比較して著しく高いことを免疫染色法で確認した。また，BPIFB1は耳下腺腺房細胞の分泌顆粒内に存在し，細胞質にはほとんど存在しないことがわかった。このことからBPIFB1はアミラーゼと同様の分泌経路を取り，唾液に分泌されると予想された。NODマウス唾液からWestern blotting によりBPIFB1が検出された。唾液中，および分泌顆粒中のBPIFB1はWestern blottingにおいて２つのタンパク質バンドとして検出された。二次元電気泳動によりこれらは分子量と等電点がわずかに異なり，グリコシダーゼ処理でやや低い分子量の１つのスポットとなったことから，２つのスポットは糖鎖を有するBPIFB1によるものと考えられた。数種のレクチンに対する結合性を調べたところ，２つのスポットはAleuria aurantia レクチンと結合したことからFucα1-6GlcNAc あるいは Fucα1-3GalNAcを持つと予想された。一方コントロールマウス（C57BL/6）では，BPIFB1は免疫染色およびWestern blottingで耳下腺腺房細胞にも唾液中にもほとんど検出されなかった。この総括として第58回歯科基礎医学会学術大会で報告し，論文投稿した（投稿中）。BPIFB1は病態体質を表す可能性があると考えられるものの，ヒト唾液における発現には個体差があり，この相違についてはまだわかっていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
BPIFB1の発現の確証は，最適な1次抗体が無いことから非常に困難であった。最も反応性が高かったマウスモノクローナル抗体には非特異的反応があり，特異的反応によるバンドを見極めることは困難であったことから，二次元電気泳動を行った。これにより，BPIFB1を分離・検出することができた。グリコシダーゼ処理およびレクチンによる糖鎖検出等の方法により，BPIFB1が独特の糖鎖を持つ可能性があることが分かった。このように，BPIFB1の発現確認が困難であったことが，予定よりやや遅れることになった一番の原因である。
一方，臨床応用として計画していた口腔乾燥症患者およびコントロール被験者から唾液を採取して保存する作業は進んでいる。この中から，典型的な口腔乾燥患者の唾液について，分担・共同研究者がプロテオーム解析を行っている。この結果はまだ解析中であるが終わりしだいマウスを用いた本研究に応用する予定である。また，唾液からmRNAを抽出する方法を確立することも予定していたが，新規に確立して論文として報告する必要があることがわかり，さらに追加実験が必要なため，予定よりやや遅れることになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は，前年度の計画であったBpifb1の遺伝子発現調節機構を明らかにすることを目標とする。関与すると予想される転写因子について，ChIP-seq法－クロマチン免疫沈降法 (chromatin immunoprecipitation: ChIP) と次世代シークエンサーを組み合わせた解析を委託する。
また，臨床応用として，集めた唾液試料についてWestern blotting を行い，BPIFB1の発現を調べる。バンドの濃度を半定量的に解析し，唾液流量との相関性を調べる。さらに唾液からmRNAを抽出する方法を確立して論文として発表する。
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| Causes of Carryover |
タンパク質の発現証明のための実験が長引き，28年度に計画していた実験に至らなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
29年度はNODマウスおよびコントロール(C57BL/6)マウス耳下腺についてのChIP-seq法による転写因子結合サイト解析を計画している。28年度助成金と29年度助成金と合わせて，この受託解析委託に充てる。
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Research Products
(1 results)
