2015 Fiscal Year Research-status Report
顔面の形態形成を制御する新規シグナルネットワークの解明
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15K11352
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
川上 正良 奈良県立医科大学, 医学部, 学内講師 (20244717)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和中 明生 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (90210989)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 発生・分化 / 細胞・組織 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 歯学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、形態形成の情報伝達となるWnt シグナル経路について、顎顔面の形成時におけるメカニズムを解明することを目的とした。Wntシグナルを阻害するためにWntレセプターのantagonistとして、Dickkopf-1（Dkk-1）を用い、上顎突起と前頭鼻突起が癒合する時期(stage 20HH)に作用させた。
ニワトリ胚をstage 20HHまでincubateしたのち、Dkk-1（1mg/ml）をBeadsに浸潤させておき、embryoの上顎突起に埋入した。
Beads埋入6時間後のembryoの上顎突起を摘出してtotal RNAを抽出し、template cDNAを作成、GAPDHを指標としてreal-timePCRを行い、上顎突起中のBmp4、Bmp7、Barx1、Tbx1、Tbx22, Fgf8b, Wnt3a遺伝子発現量を測定した。その結果、Bmp4、Barx1、Tbx22は有意に減少し、Tbx1、Fgf8bおよびWnt3aは有意な変化を認めなかった。
Dkk-1投与による細胞増殖活性の変化を調べるため、BrdUをembryoの静脈に投与した。パラフィン標本を作成して、Diaminobenzidine(DAB)による免疫組織染色を行い、BrdU陽性細胞を測定した。その結果、Dkk-1投与24時間後、48時間後で、上顎突起におけるBrdU陽性細胞の発現割合が有意に減少した。
以上の結果から、WntシグナルをDkk-1によってブロックすると上顎組織発生に関与するBmp4、Barx1、Tbx22遺伝子発現が有意に減少し、細胞増殖が減少することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度研究計画のうち；1．Beads implantaion、2．real-time RT-PCRによるBeads周囲組織のmRNAの定量、3．細胞増殖活性とapoptosis は、順調に実施され、有意義な結果が得られている。
4．In vivo electroporationは、当初予定した実験器材が製造販売中止になり、別の実験器材に変更する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、平成28年度の実験計画に沿って実施する。遺伝子発現に変化が見られない場合は、定量する遺伝子を変更する。また、Dkk-1によるWntシグナル阻害効果を検証するために、レスキュー実験として、Dkk-1投与1時間後、Alsterpaullone（GSK-3β;阻害剤）投与して、上顎突起を摘出後、RNAを抽出、上記のreal-time RT-PCRを行う。Dkk-1のWntシグナル阻害によるβ‐catenin分解に働くGSK-3βを阻害し、Dkk-1によって減少したBmp4、Barx1、Tbx22をrescueできるかどうか確認する。
また、Wntシグナル阻害による形態的変化を追跡するため、ほぼ顔面骨格が完成するstage 36（投与後10日目）のembryoを摘出し、顔面骨格および骨形成の状態を観察する
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| Causes of Carryover |
平成27年度設備備品費として計上していたTSS20 Ovodyne In ovo エレクトロポレーター一式・Intracel が、メーカーの都合により製造販売中止となり、購入できなくなった。他の実験で使用する消耗品に振り替えて支出したが、次年度使用額を生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
他社のIn ovo エレクトロポレーターを検討し、次年度以降に購入する予定である。
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