OFCD症候群における乳歯歯根吸収不全と長根形成に対する生化学的研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11369
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 西口 美由季 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10253676)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 卓 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00228975) ; 星野 倫範 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (00359960) ; 釜崎 陽子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (30253678) ; 佐藤 恭子 長崎大学, 病院(歯学系), 助教 (70404499)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: OFCD症候群 / 歯根長根 / 歯根吸収不全 / 歯髄冠細胞

Outline of Annual Research Achievements

（１）遺伝子解析：１．DNA採取：患者でOFCD症候群を疑う患者から唾液採取．Orangene・DNA®によりゲノムDNA精製 ２．BCOR遺伝子解析:得られたDNAより次世代シーケンス解析３．遺伝子変異分析:シーケンスデータと発行されているBCORシーケンス(GenBank AF317391) との比較，変異その他の遺伝子における異常な変異を検討中．これらにより多くの口腔異常を持つ患児の異常の原因が特定の遺伝子疾患によるものか否かが明確となる．
（２）歯髄細胞培養　：１．細胞準備：（患者乳歯1例、コントロールとして永久歯1例，歯根吸収不全乳歯1例，交換期乳歯3例）それぞれ同意の下，抜去歯より歯髄採取，培養，今後の研究に備え歯髄細胞を増殖・凍結し，ストックを行っている．２．歯髄細胞の増殖能の検討：患者、コントロール群として歯根未完成永久歯、歯根吸収不全乳歯、交換期乳歯についてそれぞれ歯髄細胞を同じ条件下で培養．経時的に細胞を計測（各群3回）することで歯髄の増殖曲線を作成した．その結果，患者、歯根吸収不全乳歯，根未完成永久歯，交換期乳歯の順で増殖能が高かった．本患者の歯髄細胞は増殖能が高いことが示唆された．３．歯髄細胞の観察：各細胞の培養期間中，顕微鏡観察を行い，写真撮影を行った．患者の乳歯歯髄細胞の形態は永久歯歯髄細胞に近かった。また通常の乳歯歯髄細胞に比較して，紡錘形の度合いが強く幹細胞様であった．
（３）抜去歯観察：患者同意の下，抜去歯の提供を受け外観の観察・計測後，患者1例および健常児1例の垂直断面の研磨標本（H-E染色）の作成中である．（２）および（３）の結果は歯根長根・吸収不全のメカニズムについて考察する一助となる可能性を持つ．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究を遂行するに当たり，必要な試料（唾液，歯髄細胞，抜去歯）は最低限取得済みである．
唾液より抽出したDNAを試料に次世代シーケンス解析は既に終了，OFCD症候群原因遺伝子BCORの変異もしくはその他口腔異常に関連が疑われる遺伝子の変異を検討中である。
長根や乳歯歯根吸収不全などの口腔異常をもたらす原因を予測するために必要な実験に要する細胞については，培養条件にするために時間を要したが概ね安定した状態で行うことが可能となった．
増殖能の比較実験はほぼ終了し，研磨標本も作製終了間近であり顕微鏡観察を行うことが可能である．
28年度予定の歯髄幹細胞の検出を確認するためのRNA注出も開始している。

Strategy for Future Research Activity

（1）遺伝子解析：データからの本疾患に関わりの検討を継続して行う．(2)抜去歯（患者1例および健常児1例）の垂直断面の研磨標本（H-E染色）の顕微鏡観察(3)硬組織形成能の検討:培養細胞を既報告に基づき，dexamethasone,アスコルビン酸，β-glycerophosphate含有の分化誘導培地にて培養後硬組織形成能確認のためALP, OCN, SPP1, DSPなどの骨形成時に強く発現する因子をRT-PCRにて解析する．(4)破骨細胞の誘導確認:破骨細胞分化因子（RANKL，M-CSF）の添加の有無などの条件を変え，培養細胞と破骨細胞前駆細胞との共培養にて破骨細胞分化に差異があるのかTRAP染色にて観察を行う.その結果よりOFCD患者の破骨細胞分化能について検討する. (5)OFCD児と健常児乳歯に存在する歯髄幹細胞についての差違を確認（OCT04,Sox-2,Nanogをマーカーとして）同時に間葉系幹細胞の発現を検出（CD34+, c-kit+, Sca-1+, CD73, CD105, STRO-1, CD13, CD45等をマーカーとして識別し，定量的RT-PCR, Real-time PCRを用い解析）.

Causes of Carryover

旅費の使用金額に差異を認めた．連携協力者との研究打ち合わせの際の旅費は協力者の出張時に打ち合わせを重ねて行ったために当研究費から使用しなかったためである．

Expenditure Plan for Carryover Budget

昨年未使用額は本年度，抜去歯3本分の標本作製依頼費用として予定している．