咽頭部への歯周病原細菌の定着とそれに対する生体応答についての解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K11403
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 林 潤一郎 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (30350937)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内記 良一 愛知医科大学, 医学部, 講師 (10434622) ; 福田 光男 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40156790) ; 三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (50329611)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: 歯周病原細菌 / 唾液細菌叢 / 咽頭細菌叢 / 咽頭上皮細胞 / 咽頭常在菌

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、健常者、歯周病患者、歯周病メインテナンス患者、無歯顎者より、唾液細菌および咽頭細菌を採取し、T-RFLP法にて各々の細菌叢プロファイルを調べる臨床サンプル研究と、咽頭上皮細胞を用い、咽頭常在細菌であるStreptococcus salivaliusによって前処理した細胞としていない細胞とで歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalisの感染への応答を比較するというin vitro研究の両方を実施し、咽頭へ歯周病原細菌が定着するメカニズムを解析する予定である。
平成２７年度においては、主に、臨床サンプル研究を進めてきた。健常者についてサンプル採取を開始し、別の研究で採取したサンプルと合わせて、当初予定していたサンプル数をすでに確保している。これらのサンプルについては、T-RFLP解析を開始している。併せて、個別の歯周病原細菌について、それぞれのサンプルでの検出の有無を調査している。
現在までに確保したサンプル数において、T-RFLPプロファイルによるクラスタリングで、唾液、咽頭の細菌叢をそれぞれ３つのクラスターに分け、クラスター間で歯周病原細菌の検出率と臨床パラメーターの比較を行ったところ、唾液においては、平均歯周ポケット深さが深いクラスターにおいて、歯周病原細菌の検出率が高かったが、咽頭においてはその傾向はみられなかった。他の患者群においては、まだサンプル採取を開始していないため、解析は行っていない。
in vitro研究は、まだ細胞の入手が間にあっておらず、研究が進んでいない状態である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

課題の採択が追加採択によるものであったため、研究費が使用可能となったのが平成27年12月以降であった。そのため、研究の開始が遅くなり、進捗が遅れている状況となっている。
本課題では、in vitro系の研究と、臨床サンプル研究の両面から検討を行う予定であるが、具体的な進捗では、特に、in vitro系の研究が遅れている。その理由としては、適切な細胞の入手が間に合っていないことが最大の原因である。本研究で使用を検討している咽頭上皮細胞は、申請時に計画したヒト咽頭上皮癌由来のDetroit562株であるが、他の細胞株についても文献等を確認し、より適切な細胞がないかを検討しているところである。また、S. salivaliusについても、提供を予定している施設との連絡を行っているところであり、未だ入手に至っていない。
臨床サンプル研究では、健常者のサンプルは集まっており解析を開始しているが、歯周病患者、歯周病メインテナンス患者および無歯顎者のサンプルはまだ採取が進んでいない。健常者サンプルについては、愛知学院大学歯学部附属病院口臭治療科を受診した患者のうち、口臭値が正常範囲で、歯周病についても加療の必要のない程度の歯肉状態の患者からサンプリングしている。歯周病患者については歯周病治療が開始されていない状態が望ましいため、初診時にインフォームドコンセントを行う必要があるが、初診時でのインフォームドコンセントは、患者とのラポールが形成されていない状態で行われるため、同意が困難である。そのため、必要数を採取するにはある程度の期間が必要と考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成２８年度は、臨床サンプルの研究について、歯周病患者、歯周病メインテナンス患者、無歯顎者のサンプルを集め研究を進める予定である。当該年度中に必要なサンプル数の収集を終える予定であるが、問題点として、連携研究者として咽頭サンプルの採取を実施していた耳鼻咽喉科医が研究メンバーから外れたため、新たな連携研究者の追加が急務となっている。
in vitroの実験系については、細胞の入手を急ぎ、細胞培養が可能になり次第研究を開始する予定である。P.gingivalisを咽頭上皮細胞に作用させ、TNF-αやIL-1βなどのサイトカイン産生をメッセンジャーレベル、タンパクレベルで確認し、それがS. salivalius刺激により抑制されるかどうかを調べる。次に、S.salivalius単独で咽頭上皮細胞に作用させ、TGF-βの産生亢進が確認されれば、P. gingivalis、S. salivalius共刺激系でTGF-βの阻害薬を添加し、TNF-α、IL-1βの抑制が回復するかどうかを確認する。
平成２９年度は、臨床サンプル研究については、データの解析を実施する。それぞれの群で、各サンプルのT-RFLPプロファイルを元にクラスタリングし、各々のクラスターにおける臨床パラメーターと歯周病原細菌の出現率を比較して、唾液サンプルと咽頭サンプルの関連性を調査する予定である。また、各クラスターの代表的なサンプルについて16SrRNAシークエンスにより細菌種の同定を行い、細菌叢を比較する予定である。
in vitroの実験系では、平成２８年度中に観察された現象についてシグナル伝達の解析をすすめる予定である。TLRのシグナル伝達の下流に存在するアダプター分子やシグナル因子、転写因子等についてメッセンジャーレベル，タンパクレベルで確認を行うことを検討している。

Causes of Carryover

本研究課題の採択が追加採択で行われたため、研究費使用開始が平成２７年１２月以降となった。
健常者の咽頭サンプルおよび唾液サンプルの収集は事前に開始しており、解析可能な数のサンプルを２７年度以内に収集する事ができた。そのため、T-RFLP関連試薬等の臨床サンプル研究に関わる予算の一部を使用した。それ以外のサンプルについては採取が進んでいないため、関連消耗品の購入は大部分を２８年度以降に持ち越すこととした。
in vitro研究については、細胞の入手や細菌の入手が済んでおらず、まだ研究を開始していない状態である。そのため、一部消耗品は購入したものの、該当する研究予算のほとんどは使用せず２８年度へ持ち越すこととした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成２８年度においては、２７年度中に開始できなかったin vitro研究を中心に研究費を使用する予定である。細胞とその培養に関連する試薬、細菌培養に関連する試薬、LPSやTLR作動薬等の各種リガンド、サイトカイン産生を確認するためのELISAキット、各種活性測定キット、Western blot関連試薬等の購入を予定している。
また、臨床サンプル研究についても、歯周病原菌の検出、DNA抽出、T-RFLP解析に関連した試薬を購入する予定である。これらのデータ解析では、現在、他の研究費で購入したPCを使用して実施しているが、今後の使用状況に応じて新たにPCと解析ウェアを購入する必要が生じる可能性もある。