2016 Fiscal Year Research-status Report
シロイヌナズナの多重突然変異体を利用した重力感受経路の解明
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15K11913
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
藤井 伸治 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (70272002)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 植物 / 重力 / 重力感受 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の重力感受機構は、シロイヌナズナを用いた解析により、アミロプラストの沈降とDnaJ様タンパク質であるARG1から構成されていると考えられている。重力感受におけるアミロプラストの沈降の役割は、デンプン合成の欠損によりアミロプラストが正常に沈降しないpgm突然変異体を用いて検討されてきた。しかし、これらの突然変異体で欠損している遺伝子産物は重力刺激を生体内のシグナルに変換する機能を持たないと考えられるため、未同定の重力感受分子の存在が予想される。そこで、本研究では、遺伝学的手法を用いて新規の重力感受を担いうる分子の同定を試みている。当初、arg1 pgm二重突然変異体中で機能している重力応答性の低下を指標に単離したenhancer of arg1 pgm (enap) 突然変異体に注目し解析を行ってきた。しかしながら、マッピング用系統のarg1 pgmのアリル突然変異体のrhg stf1二重突然変異体の重力屈性の低下が得られた突然変異体よりも大きく、スクリーニング法の再検討を余儀なくされた。
一方、近年、新規の重力屈性異常突然変異体としてイネの地上部の重力屈性が異常なlazy1突然変異体、タルウマゴヤシの根の重力屈性が異常なnegative gravitropic response of roots (ngr) 突然変異体の突然変異原因遺伝子が同定された。LAZY1、NGRは類似したドメイン構造を含み、重力感受に機能する可能性が予想されているが、分子機能は未解明である。我々は、イネのlazy1突然変異体に形質が類似しているオオムギの地上部の重力屈性が異常となるserpentina突然変異体が新規の突然変異原因遺伝子によって引き起こされる可能性を見出した。そこで、本研究では、serpentina突然変異体の突然変異原因遺伝子の同定を試みることとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
シロイヌナズナのarg1 pgm二重突然変異体中で機能する重力応答性を低下させる突然変異体の単離のためには、Lerをバックグラウンドとしたarg1 pgmのアリル突然変異体のrhg stf1二重突然変異体の種子に突然変異を誘発する必要があると考え、rhg stf1二重突然変異体の採種を行い、突然変異誘発を行う種子を確保した。
オオムギのserpentina突然変異体は、ガンマ線照射により突然変異を誘発した60万のM3個体をスクリーニングし、単離された横伏成長する突然変異体である (Suge et al., Biological Science in Space 3: 363-364, 1989)。オオムギのserpentina突然変異体の形質が、イネのlazy1突然変異体に酷似していたため、OsLAZY1遺伝子に類似しているオオムギのHvLAZY1の塩基配列を野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体とで比較した。LAZY1はトウモロコシ (ZmLA1)、シロイヌナズナ (AtLAZY1) でも同定されており、LAZY1タンパク質には5つの保存されている領域 (ドメインI ~ V) が見出されている。解析の結果、serpentina突然変異体で、3ヶ所の塩基置換を見出し、そのうち一つがドメインIIでのイソロイシンからロイシンへの非同義置換であった。ロイシンはイソロイシンの構造異性体であり、また、共に疎水性アミノ酸であるため、本アミノ酸置換がLAZY1タンパク質の活性に甚大な影響を与えるとは考えにくい。また、serpentina突然変異体のHvLAZY1遺伝子にはガンマ線照射により誘導が期待されるDNAの欠損は認められなかった。そこで、本研究では、引き続きserpentina突然変異体の突然変異原因遺伝子の検証・同定を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
オオムギのserpentina突然変異体で見出されたミスセンス突然変異HvLAZY1I73Lが、突然変異原因遺伝子となり得るかを検証するため、野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体とを交配して得られたF2後代を用いて、地上部の重力屈性の異常とミスセンス突然変異を引き起こす塩基置換 (A217C) との連鎖を検討する。現在、野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体とを交配して得られたF1後代を生育させ、F2後代を採種している。
オオムギのserpentina突然変異体はDNAの欠損を引き起こすガンマ線照射により突然変異が誘発されているため、欠損したDNA領域上の遺伝子の発現の消失が期待される。そこで、野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体との遺伝子発現をAffymetrix GeneChipより網羅的に比較し、serpentina突然変異体で発現が低下している遺伝子を探索し、欠損が生じたDNA上の遺伝子候補とする。そして、ゲノムDNAを鋳型とし、それらの遺伝子に対するPCRを行い、serpentina突然変異体由来のゲノムDNAでは増幅されない遺伝子を見出す。増幅されない遺伝子が見出された場合、その周辺の遺伝子についても同様に解析し、serpentina突然変異体のゲノムDNAで欠損している領域を特定する。そして、F2集団を用いて、見出したserpentina突然変異体で欠損したDNA領域と、地上部の重力屈性の異常との連鎖を解析するとともに、領域内の遺伝子群のうちserpentina突然変異体の突然変異原因遺伝子を絞り込む。
また、シロイヌナズナのarg1 pgm二重突然変異体を用いた解析では、スクリーニング法を再検討する
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| Causes of Carryover |
昨年度、serpentina突然変異体で発現が低下している遺伝子を探索し、欠損が生じたDNA上の遺伝子候補とするため、野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体との遺伝子発現をAffymetrix GeneChipより網羅的に解析した。現在、その解析結果を精査している。本解析結果が不十分な場合、再度、Affymetrix GeneChipによる網羅的な遺伝子発現解析を実施できるように、経費を次年度に使用できるようにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
既に得られているAffymetrix GeneChipよる野生型 (竹林茨城1号) とserpentina突然変異体との網羅的な遺伝子発現の比較解析結果が不十分な場合、再度、Affymetrix GeneChipによる網羅的な遺伝子発現解析を実施するための経費に当てる。もし、現在、得られている解析結果により、欠損が生じたDNA上の遺伝子が特定できた場合は、本経費を研究遂行のための酵素類、合成オリゴヌクレオチド、プラスチック消耗品に当てる予定である。
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[Journal Article] The gravity-induced re-localization of auxin efflux carrier CsPIN1 in cucumber seedlings: spaceflight experiments for immunohistochemical microscopy.2016
Author(s)
Yamazaki C, Fujii N, Miyazawa Y, Kamada M, Kasahara H, Osada I, Shimazu T, Fusejima Y, Higashibata A, Yamazaki T, Ishioka N, Takahashi H.
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Journal Title
npj Microgravity
Volume: 2
Pages: 16030
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] A Pathway that Laterally Transports Auxin from the Upper Side to the Lower Side of the Transition Zone of Cucumber Seedlings via Endodermal Layers is Formed Due to Gravitstimulation2016
Author(s)
Nobuharu Fujii, Chiaki Yamazaki, Yutaka Miyazawa, Motoshi Kamada, Haruo Kasahara, Ikuko Osada, Toru Shimazu, Yasuo Fusejima, Akira Higashibata, Takashi Yamazaki, Noriaki Ishioka, Hideyuki Takahashi
Organizer
11th Asian Microgravity Symposium
Place of Presentation
Hokkaido University (Hokkaido, Sapporo)
Year and Date
2016-10-25 – 2016-10-29
Int'l Joint Research
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