Construction of a novel cellulolysis system utilizing Tetrahymena

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K12263
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 遠藤 浩 金沢大学, 自然システム学系, 准教授 (20272932)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: テトラヒメナ / 分泌ベクター / シロアリ腸内共生ベン毛虫 / エンドグルカナーゼ / セロビオヒドラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

原生動物テトラヒメナを用いて外来遺伝子の発現ベクターの開発・改良を行った。このベクターは、１）ネオマイシン耐性遺伝子 (NeoR)の入ったスクリーニング用カセット、２）２種類のプロモーター (カドミウム誘導性メタロチオネイン１＜MTT1p＞、常時発現型LSUリボソームタンパク質＜Rpl2p＞)、およびシステインプロテアーゼの分泌シグナルを組み込んだ発現カセット、および３）相同組換えのための導入遺伝子座（ミオシン13<Myo13>またはベータ-チューブリン1<BTU1>）の周辺配列からなる３つのユニットからなる。このベクターの発現カセットに、シロアリ腸内共生鞭毛虫由来の４種のセルラーゼ遺伝子（EG5: Endoglucanase 5、EG7、CBH: Cellobiohydrolase、リグニンエステラーゼCip2-like）をそれぞれ組み込み、発現誘導・分泌後、培養液を回収し、セルラーゼ活性を測定した。
新ベクター(pTtSec2-MTT1p、pTtSec3-Rpl2p)では、以前のベクターに比べ、EG5、EG7両方で10～50倍程度の活性が検出され、改良型ベクターは分泌、活性の発現に十分な能力をもつことが確認された。リグニンエステラーゼであるCip2-likeに関しては、細胞外液を10倍濃縮した時に、EG活性を1.3倍程度上昇させた。最終年度はCBHの活性検出に集中し、様々な遺伝子改変を行ったが、これまでのところ活性は検出できていない。CBHの異種発現は難しいようである。
以上の結果は、原生動物繊毛虫類に属すテトラヒメナが、外来タンパク質の発現系として、大きなポテンシャルを秘めていることを示唆し、新しい物質産生生物になる可能性を示したと言える。しかし、CBHの発現が成功していない現状では、新たなセルロース分解システムとして工業化へ向かうのは時期尚早と判断せざるをえない。