新手法によるビタミン機能の解明：補酵素結合RNAの探索と機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K12347
• Research Institution: Fukuoka Women's University
• Principal Investigator: 濱田 俊 福岡女子大学, 国際文理学部, 教授 (60282349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 濱田 香世子 福岡女子大学, 国際文理学部, 学術研究員 (20448814)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: リボザイム / ビタミンB12

Outline of Annual Research Achievements

チアミンおよびシアノコバラミンと結合する生体内RNAを探索するために実験系の作成を行った。
まず、実験系の作成に必須のコントロールRNAの調製を行った。チアミンおよびシアノコバラミンンが結合しリボスイッチとして機能するRNA領域、大腸菌コバラミン・オペロンと枯草菌チアミン・オペロンのleader配列をPCR法で増幅しpBluescript IIベクターにクローニングした。塩基配列を確認後、試験管内転写反応によりセンス鎖RNAを陽性コントロール、アンチセンス鎖RNAを陰性コントロールとして合成した。また、RNA結合用ビーズとして、NHS活性化セファロースにシアノコバラミンを結合させたビーズを作成した。
次に、このシアノコバラミンを結合させたビーズが陽性コントロールRNAに結合するかどうか確かめるために、生後0日令マウス全身由来の総RNAに陽性コントロールRNAもしくは陰性コントロールRNAを加えたRNAを用いて結合実験を行った。前年度は1 mlのセファロースビーズにフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を固相化したカラムを用いて、FADに結合するRNAの分離を試みたが、非特異的にビーズに結合するRNAが多かったため、今年度は試験管内選択法（SELEX法）を参考にし、比較的少量のビタミン結合ビーズ(10μl)を実験に使用した。また、非特異的なRNAの吸着を減らすため、シアノコバラミンを結合させていないビーズによってRNAを前処理（吸収）した。RNAを熱変性後、急冷させてから、前処理用ビーズ、続いてシアノコバラミン固相化ビーズと反応させ、洗浄後、結合したRNAをシアノコバラミン溶液で競合溶出した。RNAをアルコール沈殿により回収し、逆転写反応によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にしてPCRを行い、陽性および陰性コントロールRNAが存在するかどうか検討した。しかし予想に反し、陽性コントロールRNAは検出できず、実験系について再検討する必要があることがわかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

セファロースビーズに固相化したビタミンで計画通り実験が進まない場合には免疫沈降法によりRNAと複合体を形成したビタミンB12をpull downすることを計画していたが、今年度は実施できなかったため。

Strategy for Future Research Activity

研究期間を１年間延長し、今年度できなかった実験を行う。

Causes of Carryover

研究の遅れにより生じたもの。

Expenditure Plan for Carryover Budget

免疫沈降法および分子生物学実験に必要な試薬、RNAを抽出するための実験動物、プラスチック器具の購入に使用する。