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2015 Fiscal Year Research-status Report

ヒト薬物代謝酵素を用いたマイコトキシン汚染食品の浄化技術に関する研究

Research Project

Project/Area Number 15K12354
Research InstitutionKobe University

Principal Investigator

今石 浩正  神戸大学, 学内共同利用施設等, 教授 (50223318)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsアフラトキシン / シトクロムP450 / 変異原性 / 解毒 / 大腸菌 / CYP3A4
Outline of Annual Research Achievements

アフラトキシンB1(AFB1)は、主にAspergillus flavus (A. flavus)により産生されるマイコトキシンの一種で、変異原性、発がん性を持つことが知られている。防カビ剤や熱処理、オゾンガス、放射線照射などの多様な手法がA. flavusの生育阻害やAFB1の不活性化のために用いられつつあるが、現在まで食品にダメージを与えず付着したこれらのAFB1を効率よく解毒可能な方法は知られていない。そこで本研究では、ヒトの薬物代謝酵素を利用することで、常温・常圧下でAFB1を解毒する新たな手法の開発を試みた。
本研究で用いたヒトシトクロムP450(CYP)の一種であるCYP3A4は、生体内において、AFB1を高い発がん性を持つアフラトキシンB1-8,9-エポキシド(AFBO)へと変換する主酵素である。一方、AFBOの半減期は約5秒間程度と短く、再度毒性化されないことも確認されている。そこで本研究では、ヒトCYP3A4を発現した大腸菌を用いて生体外でAFB1を一過的に高毒性のAFBOへと変換させる事で、AFB1による食中毒を防止できるのでは無いかと考えた。さらに、本大腸菌を微生物反応触媒として用いる目的で、凍結乾燥によるCYP3A4発現大腸菌菌体の保存安定性を検討した。

CYP3A4発現大腸菌菌体によりAFB1標品を代謝させた結果から、アフラトキシンQ1(AFQ1)が生成することが判明した。一方、本代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなった。また、実汚染食品サンプルとしてA. flavus 感染食品を作製し、本システムによるAFB1解毒能を評価した。さらに、凍結乾燥CYP3A4発現大腸菌の保存安定性に関しては、14日間の常温保存後もCYP3A4によるAFB1代謝能は失われないことが分かった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

以下の理由により当初計画以上に進展していると判断した。
1)CYP3A4発現大腸菌菌体によりAFB1標品を代謝させた後、HPLCにより分析した結果、AFB1代謝物と見られるHPLCピークが観察された。LC-MS分析の結果から、このHPLCピークは、アフラトキシンQ1(AFQ1)であることが判明したため。
2)代謝物に対してUmuテストを行った結果、AFQ1は変異原性を失っていることが明らかとなっていたため。
3)AFB1産生A. flavus 懸濁培養液を用いた解析からも、同様にAFB1が代謝されていることが確認できたため。

Strategy for Future Research Activity

1)食品中のアフラトキシンを検出する際に、蛍光を用いたAFB1の検出は頻繁に使用されている。法定濃度である10ppb付近が検出限界である従来のHPLC-UV検出を超える検出感度で、蛍光によるAFB1の検出が高感度に行うことができれば、汚染食品の解毒を確認できると考えられる。よって次年度以降は蛍光HPLCによる分析法を検討する。

2)先の研究から、蛍光分光光度計を用いてAFB1の蛍光値を測定した結果では5ppb程度までのアフラトキシンを検出できるものと考えられる。また、A. flavus懸濁液およびA. flavus感染トウモロコシのからAFB1を抽出する際にはイムノアフィニティカラムのAFLAKINGを用いる予定である。

Causes of Carryover

アフラトキシンB1(AFB1)の代謝・分解を評価する過程で、Umu試験による変異原性評価を予定していた。今回、生化学工業から販売されているUmu試験用キットの利用を検討していたが、オリジナルの手法を開発したために当該キットを利用する必要が無くなった。また、当初予定していた高速液体クロマトグラフィー装置については、学内の代替機種が利用可能となり、予算的に当初計画を下回る結果となった

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度以降の検討課題である高感度液体クロマトグラフィー解析用に、カラムを購入する必要がある。次年度は主にこれら高額カラムの購入費用に繰越金を利用する必要があると考えられる。

  • Research Products

    (9 results)

All 2015 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (6 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Point mutation of cytochrome P450 2A6 (a polymorphic allele CYP2A6.25) confers new substrate specificity towards flavonoids2015

    • Author(s)
      Uno, T., Ogura, C., Izumi, C., Nakamura, M., Yanase, T., Yamazaki, H., Ashida, H., Kanamaru, K., Yamagata, H., Imaishi, H.
    • Journal Title

      Biopharm. Drug Dispos

      Volume: 36 Pages: 552-563

    • DOI

      10.1002/bdd

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Functional characterization of CYP1A9 and CYP1C1 from Anguillus japonica.2015

    • Author(s)
      Uno T, Izumi C, Takenaka S, Yanase T, Imaishi H, Kanamaru K, Yamagata H, Kaminishi Y, Itakura T.
    • Journal Title

      Environ Toxicol Pharmacol.

      Volume: 40 Pages: 360-368

    • DOI

      10.1016/j.etap

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 真核生物のP450活性を制御する新規遺伝子の探索と利用2015

    • Author(s)
      河合佑樹,原茅乃,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] CYP3A4を用いたマイコトキシン汚染食品浄化技術の開発2015

    • Author(s)
      初田浩志,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] P450発現のエピジェネティック制御に対する非変異原性化学物質の影響に関する研究2015

    • Author(s)
      池田直樹,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 潰瘍性大腸炎の新規診断技術の開発2015

    • Author(s)
      山本龍一,室井康平,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] 食品成分によるマイコトキシンの毒性抑制に対するヒト遺伝子多型の影響2015

    • Author(s)
      渡辺浩行,室井康平,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] CYP2A6酵素活性変化に関与する新規タンパク性因子のスクリーニングと機能解析に関する研究2015

    • Author(s)
      原茅乃,河合佑樹,今石浩正
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      兵庫県・神戸市・神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Remarks] 神戸大学 環境物質科学研究室

    • URL

      http://www.research.kobe-u.ac.jp/rceg-nowstone/index.html

URL: 

Published: 2017-01-06  

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