2015 Fiscal Year Research-status Report
筋芽細胞の膜融合過程を担う分子機構の解明－新たな筋障害治療ターゲットの探索
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15K12580
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
亀高 諭 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10303950)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 骨格筋修復 / C2C12 / 蛋白質輸送 / 膜融合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス培養筋芽細胞C２C１２を用いて、筋分化、筋修復過程における細胞膜融合メカニズムの分子機構を明らかにする目的で、C２C１２細胞の筋分化に必須な遺伝子を探索した。探索に先立ち、筋分化効率の高いC２C１２筋芽細胞株を探索し、幾つかの高分化効率を有するクローンを単離した。得られたクローンを用いてRNAi法によりゴルジ体、エンドソームで機能するクラスリンアダプター分子、GGA1(Golgi-localized, gamma-ear containing, adaptor protein 1)がC２C１２細胞の骨格筋分化に重要な役割を担っていることを見出した。哺乳動物には構造、機能的に類似した３つのGGA遺伝子（GGGA1, 2, 及び3）が存在することから、これらの分子の筋分化における機能解析を行うことを企画したが、これらの分子群に対する良い抗体が市販されていないことからこれらの抗体を作成し、特異抗体を得ることに成功した。C２C１２細胞における内在性GGAの発現解析を行った結果、GGA1筋分化過程において発現量がmRNAレベルで上昇すること、またGGA1はC２C１２細胞内においても他の細胞と同様にゴルジ、エンドソームに局在することが明らかとなった。類縁分子であるGGA2, GGA3に関しても同様の解析を行ったところ、GGA3はGGA1同様に筋分化に重要である可能性が示唆される一方で、GGA2はノックダウンにより筋分化は阻害されなかったことから、GGA1, 3とGGA2が筋分化において異なる機能特異性を有していることが示唆された。GGA1, 3はGGA2にはないユビキチン結合能を持つことが示唆されていることから、ユビキチン化されたカーゴ分子が筋分化に重要である可能性を考え、カーゴ分子の探索を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね研究計画に従い結果が出ている。siRNAによるゲノムワイドスクリーニングを行う前のパイロット実験により目的の表現型に関わる遺伝子を見いだすことができたため、予定よりもかなり早いペースで遺伝子機能解析をスタートすることができている。ターゲット遺伝子及びその類縁遺伝子に対する特異抗体も特異性の高いものを作成することができ、今後、相互作用分子の探索などに進むことが可能となっている。一方でゲノムワイドスクリーニングに関しては準備が遅れており、現時点では初年度で見出したGGA蛋白質の機能解析を中心に、マウス個体骨格筋への遺伝子導入システムを用いた実験を開始できる準備が整いつつある。
また、シグナル伝達系、キナーゼ、プロテアーゼ、フォスファターゼ、など様々な細胞内システムの約４０の阻害剤を用いてC２C１２細胞の筋分化への影響を調べたところ、オートファジーを誘導するラパマイシンにより特異的に筋分化が阻害されること、オートファジーの阻害剤である3-メチルアデニンにより筋分化が促進されることを見出した。これらの結果はオートファジーによる細胞内蛋白質分解が筋分化過程に関与していることを示唆している。興味深いことに近年我々はゴルジ体で機能するクラスリンアダプターの機能とオートファジーとのクロストークについて知見を得始めており、今後これらの点についても解析を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
先に見出されたクラスリンアダプターGGAsの骨格筋分化への関与については、プロジェクトのメインストリームとして研究を推進する。具体的にはGGA1, 3に特異的なカーゴ分子を、分化中のC２C１２由来のcDNAライブラリを用いたツーハイブリッドスクリーニングにより探索する。また、C２C１２細胞を用いてCRISPR/cas9システムによるゲノム編集法によりGGAノックアウト細胞を構築し、GGAの筋分化における機能を確認するとともに、マウス骨格筋への遺伝子導入システムにより、生体骨格筋においてshRNAベクターを用いたノックダウンを行い、筋障害からの筋修復過程におけるGGA蛋白質の重要性について検討する。また、阻害剤実験より示唆されたゴルジ体で機能するクラスリンアダプターの機能とオートファジーとのクロストークに関しても解析をさらに進める。具体的にはGGAの相互作用因子としてすでに同定しているVCP/p97についてオートファジーや骨格筋萎縮への関与が示唆されており、GGAとともに機能解析を進める。
遺伝子導入システムの構築に想定外の予算が必要であることが分かったことから、次年度予算の前倒し申請が必要であることが予測される以外、プロジェクトの推進に特に問題はない。
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| Causes of Carryover |
予定よりも研究進行状況に変更があったため予定していた試薬を購入しなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に早急に予定した試薬を購入する費用に充てる
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