2015 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌由来チトクロームP450の収束型ライブラリーの構築と新機能の探索
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15K12737
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
及川 英秋 北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00185175)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | チトクロームP450 / 酸化酵素 / 天然物 / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
計画通り３種のベクター(pUARA2, pUSA2, pAdeA2)を用いて、麹菌Aspergillus oryzae NSAR1株を宿主として、P450発現ライブラリーの調製を行った。Penitrem生合成系で見出された水酸化（PtmJ）、エポキシ化（PtmL）、環拡大（PtmK）を触媒する酵素遺伝子を一つのベクターに組込んだ。同様にaflatrem生合成に関与する、メチル基の酸化的脱離およびアリル位酸化の5段階を触媒するAtmPおよび二箇所の縮環位の酸化を行うAtmQ導入ベクターなど、「Bet2 (betaenone), PbP450-1/PbP450-2 (aphidicolin), CntC (cinatrin), Sol6 (solanapyrone), CcsD (cytochalasin)」合計12個の遺伝子を組込んだ形質転換株ライブラリーを作成した。
新規変換反応を検討するためのライブラリー構築と並行して、ophioblolinの水酸化反応を検討した。Ophioblolinの生産が確認された菌株Bipolaris maydes, Emericella variecolor由来のチトクロームP450水酸化酵素OblB-Bm／OblB-Evの場合、トランスポーターOblD-Ac存在下でのみ、４段階の酸化生成物であるophioblolin Cを生産するのを見出した。これに対しophioblolinの非生産株と言われてながら、ophioblolinの生合成遺伝子クラスターを持つAspergillus clavatus由来の相同性の高いP450 OblB-Acの場合, トランスポーターOblD-Ac非存在下で前駆体を投与することにより、４種の異常生成物を与えた。このように相同性の高い酵素間で酸化する位置が異なるのは、大変興味深い結果である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画したライブラリー構築は順調で、このほか新たに特徴的な反応を触媒するP450遺伝子「Nf-P450 (sesterfisherol), UstC (ustiloxin), SpdJ (sespendol), JanP/JanQ (shearinine), AsolA/AsolB (didymellamide), HirJ (hirsutellone), PlmB/PlmC/PlmD (pleuromutilin)」など合計10種を発見し、その機能を解析し、ライブラリーに加えることができるなど、順調に計画は進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後従来法に加え、酵母の相同組換え能を利用したプラスミド構築法も適用し、迅速で着実に4個の遺伝子を導入したライブラリー構築も行う。これまで2個の遺伝子を導入した二種のプラスミドを同時導入する方法では、4種同時導入株のスクリーニングに労力がかかっていたが、大幅に効率化できる。こうしたライブラリーを用いて物質変換能を検討する予定である。
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