2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞分裂タンパク質集合体のダイナミクス解明のための超分子リクルート技術の開拓
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15K12747
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小野田 晃 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (60366424)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞分裂 / 活性発現の分子機構 / タンパク質集合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞分裂を制御する FtsZ タンパク質集合体が作り出す膜分断の作用機序の解明を目的として、FtsZ タンパク質集合体の動的構造変化を、超分子リクルート技術により変調可能な系を創製し、溶液中における集合化挙動を原子間力顕微鏡などの手法を利用して明らかにする。具体的には、FtsZ タンパク質集合体をリポソーム二重膜上にアンカリングして、超分子リクルートが FtsZ の集合化挙動とリポソーム二重膜のダイナミックな構造変化に及ぼす効果を実証する。昨年度は、超分子リクルート技術のための FtsZ 集合体をリポソーム調製と溶液状態における集合体の構造解析を実施した。本年度は、リポソーム二重膜上における集合化挙動観察に取り組んだ。ジオレイルホスファチジルグリセロール 、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンとホスファチジルコリンを混合したリポソームを調製後、リポソーム二重膜へFtsZ を固定化した。リポソームには蛍光ラベルした脂質を加えて可視化できるようにし、蛍光顕微鏡によりFtsZ タンパク質集合体の構造を時間変化を観察した。その結果、膜相互作用ペプチドをフュージョンしているために、リポソームの表面にFtsZ タンパク質集合体が存在していることを確認した。さらに、FtsZ タンパク質集合体が固定化されたリポソームを含む系にストレプトアビジンを添加後、蛍光顕微鏡観察を行ったところ、ストレプトアビジンがFtsZ タンパク質集合体に相互作用することにより、リポソーム膜の膜陥入が誘起されることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、FtsZ 集合体をリポソーム二重膜上に固定化し、蛍光顕微鏡による観察を予定通りに、計画を遂行した。当初予定に反して、FtsZ を蛍光色素修飾した際には、集合体の構造変化が阻害されることが判明したために、リポソームの構造変調をリポソーム標識によるアプローチに切り替えて観察を実施したが、概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、リポソーム二重膜における FtsZ 集合体の形成と超分子相互作用による動的秩序の変調を、蛍光標識した脂質を使ったリポソームを用いた観察する。すでに、予備的に、膜上での湾曲構造やリング状構造の形成の観察に成功しており、より詳細な時分割観察に加えて、表面電荷やサイズ、曲率の異なるリポソームを使った実験を実施し、FtsZ集合体の構造変調の特性を明らかにする。昨年度に引き続き、マイクロフルイディクスを利用した時空間プログラミングによる FtsZ 集合体の機能解明にも着手する。マイクロフルイディクスの手法を取り入れて、FtsZ 集合体をリポソーム膜の内側に選択的に固定化し、また、リポソームのサイズ、構造、に加えてリポソーム内の含まれるタンパク質濃度を均質にした系において、膜構造のダイナミクスを評価する。
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| Causes of Carryover |
構造変化を起こすタンパク質をリポソームと混合してイメージングをするために、蛍光標識したタンパク質を調製したところ、当初の予定に反して、構造変化を生じないことが判明したため、新たな標識手法を検討の上、リポソームと混合してイメージングを行う必要が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
タンパク質集合体によるリポソームの構造変化を観察を可能にするための標識試薬の購入、また、マイクロフルイディクスを用いて、FtsZ 集合体をリポソーム膜を混合して内側に選択的に固定化し、リポソーム内に含まれるタンパク質濃度を均質にした系において、膜構造のダイナミクスを評価するために必要な消耗品の購入を計画している。
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