2015 Fiscal Year Research-status Report
次世代チオクロモン型ケージド化合物の創成と新規細胞セレクション法の開発
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15K12748
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
垣内 喜代三 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (60152592)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ケージド化合物 / アンケージング / チオクロモン / 生理活性分子 / 長波長紫外光照射 / 核酸 / アンチセンス分子 / ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、新規細胞セレクション法の開発を目指し、我々の開発した新規チオクロモン型光解離性保護基を用いたケージド化合物を合成し、光照射により生命分子が機能を発現する時期と場所を高度に制御するだけでなく、チオクロモン型保護基が有する、光脱保護時に極めて強い蛍光を発するという特性を最大に活かして、その位置情報の可視化及び蛍光強度測定による定量化を行う。
本年度は、DNA構成要素であるチミジンに注目し、ケージドチミジンとすることでヌクレオシド同士が相補的な水素結合によるワトソン－クリック塩基対を形成することを抑制するとともに、光照射により保護基が外れることで元の塩基対形成が復元することを検討した。これまでのケージングではチオクロモン型保護基をエステル結合を介して導入していたが、本研究ではエーテル結合を介して導入した。その結果、光照射により蛍光強度の増加が確認されたが、蛍光体の構造は予想とは異なる構造であった。詳細な検討の結果、ケージドチミジンへの光照射により、蛍光を発する中間体が生成し、その中間体にさらに光を照射することで、蛍光強度の減少を伴いながら元のチミジンが再生することが明らかとなった。つまり蛍光強度をモニターすることで脱保護プロセスを追跡可能な系が確立できた。
さらにケージドチミジンを有するケージドオリゴ核酸を合成し、これをルシフェラーゼ酵素のmRNAに対するアンチセンス分子として利用したところ、ケージドアンチセンス分子では通常通りのmRNA発現に伴うルシフェラーゼの発現が確認されたのに対し、光を照射することでアンチセンス分子としての機能が復元し、ルシフェラーゼの発現が抑制されていることが確認された。これらの結果から、光照射をトリガーとする機能制御を達成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では我々が開発したチオクロモン型光解離性保護基をケージドチミジンへと展開するとともに、それを導入したケージドアンチセンス分子の合成に成功した。さらに、光照射の有無によりアンチセンス分子としての機能を制御することにも成功しており、研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後については、合成したケージドアンチセンス分子の細胞内評価を目指す。特に細胞内における蛍光強度での評価を詳細に検討することで、フローサイトメトリーへの適用可能性を検討することを予定している。この結果を踏まえ、光照射により細胞内でアンケージングされ、目的遺伝子の機能が抑制されている細胞のみを光分解後の蛍光を指標にしたフローサイトメトリーによりセレクションするという最終目標の達成を目指す。
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| Causes of Carryover |
細胞内評価への展開を予想しそれに伴う試薬の購入を予定していたが、蛍光を発する中間体の構造決定に時間を要し、当初の計画よりは進捗が若干遅れたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
すでに構造決定は完了し、細胞外での研究については当初の目標を達成していることから、次年度に当初予定していた試薬の購入などに充てる。
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