2016 Fiscal Year Research-status Report
オルガネラ選択的オートファジーの新奇可視化法の開発
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15K12749
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (30296868)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オートファジー / マイトファジー / ペキソファジー / リソソーム / GFP / pHluorin / タンパク質分解 / オルガネラ分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジーは細胞内バルク分解システムで、神経変性疾患の発症を抑止している。申請者らは、オートファジーの中でも、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患に深く関与するマイトファジー（ミトコンドリア特異的オートファジー）をリアルタイムでモニターする測定系の開発を目指し、昨年度、IRESを用いてミトコンドリア標的シグナルをもったpHluorin-mitoとmKate2-mitoを単一プロモーターで発現するプラスミド（pHluorin-mito-IRES-mKate2-mito）を作成した。本年度は定量的評価のために安定発現させる細胞株を容易に作成できるようにするために、エピゾーマル型プラスミド、pEoEF1、を用いたpHluorin-mitoとmKate2-mito発現系の確立をおこなった。
ペルオキシソームは環境攪乱化学物質の代謝に関与しており、攪乱物質がペルオキシソーム増殖因子として働く。また酸化ストレスに応じて、障害を受けたペルオキシソームはペキソファジー（ペルオキシソーム特異的オートファジー）によってリソソームにより分解される。しかしながら、ペキソファジーを高感度・リアルタイムで可視化モニターする測定系は未だ開発されていない。そこで我々はpHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質に、ペルオキシソーム局在配列をつけペルオキシソームに局在する場合には、緑色・赤色の２重蛍光を発し、酸化ストレス等によりペキソファジーが誘導された場合にはペルオキシソームがオートファゴソームに取り囲まれ、リソソームに融合した時点で赤色蛍光のみを示すことで、ペキソファジーを可視化・モニターできるプローブを作成した。
ダイナミックな膜動態を伴うオートファジーに於いて、ゴルジ体を介した膜輸送は重要な機能ユニットであるため、ゴルジ体のpHをモニターする系も作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイトファジーを定量的評価のために安定発現させる細胞株を容易に作成できるようにするために、エピゾーマル型プラスミド、pEoEF1、を用いたpHluorin-mitoとmKate2-mito発現系の確立した(pEoEF1-pHluorin-mito-IRES-mKate2-mito)。COS1細胞にこのプラスミドを導入し、ミトコンドリアへの局在を確認した。pHluorin-mitoでは一部細胞質に拡散する傾向が認められた。EGFP-mitoではそのような事はないので、pHluorinはGFP variantの一つであるが、細胞質へ分布しがちな傾向はpHluorin特有のものの可能性が高い。pHluorin-mitoの一部細胞質に拡散する傾向は、共焦点レーザー顕微鏡ではあまり問題にならないと思われるが、通常の蛍光顕微鏡を用いてマイトファジーを解析しようとすると問題になる可能性がある。この点は慎重に検討する必要がある。
ペキソファジーを高感度・リアルタイムで可視化モニターする測定系を開発するためのpHluorin-mKate2タンデム蛍光蛋白質にペルオキシソーム局在配列をつけたペキソファジープローブは作成できた。現在、ペルオキシソームへの局在を確認中である。
ダイナミックな膜動態を伴うオートファジーに於いて、ゴルジ体を介した膜輸送は重要な機能ユニットであるため、ゴルジ体のpHをモニターする系も作成した。通常、オートファジーの活性を測定するために、V型H+-ATPaseをバフィロマイシンA1によって阻害する方法が汎用されている。しかしながら、V型H+-ATPaseは様々なオルガネラに分布するために、バフィロマイシンA1による評価法は、好適とは言えない可能性がある。その評価のために、ゴルジ体のpHをモニターする系を作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度が研究計画の最終年度にあたるため、現在までに作成したプローブを用いた評価法について、マイトファジーのアッセイ法、ペキソファジーのアッセイ法、オートファジー評価系におけるゴルジ体の構造および内腔pH変化について、データをまとめ、各々の研究を学会発表・論文発表へとつないでいく予定である。
マイトファジーについては、pHluorin-mitoとmKate2-mitoを用いて、HeLa細胞における定量評価法についてまとめる予定である。同時に、細胞によってはParkinの発現量に影響をうけマイトファジーが見られない物があるので、その点も改良できればと考えている。
ペキソファジーについては、酸化ストレスによって誘導されるペキソファジーを評価し、併せて、酸化ストレスを誘導する環境因子にも注目して解析をおこなう。
ゴルジ体のpHについても、オートファジー評価条件におけるバフィロマイシンA1の影響について調べ、カテプシン阻害剤のゴルジ体への影響の有無と併せて、研究を展開していく。予備実験的にはバフィロマイシンA1処理によって、ゴルジ体の形態も変化し、ゴルジ体内腔のpHも中性付近に上昇しているようである。これをオートファジーフラックスアッセイに用いられる別のカテプシン阻害剤と比較して、ゴルジ体における影響の有無、オートファジー活性評価における問題点・改良点について検討する。
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| Causes of Carryover |
当初、想定していた消耗品に幾つかについて、よりやすい製品が実験につかえたので安くてすんだ。また、研究推進を優先して国内外の学会の参加を見送った。論文の投稿料・校正費用があまりかからなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度にあたり、より発展的な研究へと進展できるように実験をすすめる。また研究成果をまとめ、論文投稿・学会発表を積極的に行なうために、使用する予定である。
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[Journal Article] Occludin-knockout human hepatic huh7. 5.1-8-derived cells are completely resistant to hepatitis C virus infection.2016
Author(s)
Yoshitaka Shirasago, Yoshimi Shimizu, Isei Tanida, Tetsuro Suzuki, Ryosuke Suzuki, Kazuo Sugiyama, Takaji Wakita, Kentaro Hanada, Kiyohito Yagi, Masuo Kondoh, Masayoshi Fukasawa
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Journal Title
Biological and Pharmaceutical Bulletin
Volume: 39
Pages: 838-848
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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