2016 Fiscal Year Annual Research Report
Constructing an in vitro screening system of peptides that inhibit the function of membrane proteins
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15K12756
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松浦 友亮 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (50362653)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | スクリーニング / 膜タンパク質 / ペプチド / 無細胞翻訳系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、研究代表者らが近年開発した無細胞翻訳系を用いたリポソーム内膜タンパク質合成技術（Fujii, Matsuura et al., PNAS, 2013; Fujii, Matsuura et al., Nat Protoc, 2014）を応用し、大腸菌由来の多剤排出トランスポーターEmrEの基質輸送活性を阻害するペプチドの創出を目指す。ここではEmrEを標的とするが、本研究を遂行することで実験系が確立できれば、様々な膜タンパク質の阻害剤開発にも応用可能である。
具体的には、EmrEがホモダイマーを形成することを利用し、これを阻害するペプチド配列を創生を目指した。昨年度までに、EmrEの活性を阻害する配列として、EmrEと会合することでEmrEの輸送活性を低下させる配列E14Cと会合に無関係な配列LysZRSの２種類の遺伝子を用意した。今年度は、EmrEの活性がLysZRSを加えたときより、E14Cを添加したときの方が低下する事を条件を見いだした。すなわち、EmrEのE14Cによる阻害活性が確認できる条件を明らかにした。
次に10アミノ酸のランダムペプチドライブラリーを構築した。N末端にFLAG-tag配列を持ち(NNK)10コドンを用いてオリゴDNAを調製した。NNKを用いているためTGA終止コドンが入った配列が存在する。そこでリボソームディスプレイ法により、N末端に付与したFLAG-tagを用いて終止コドンを取り除いたランダムペプチドライブラリーを調製した。
このライブラリーを用いて、上記で明らかにした実験条件でEmrEを阻害するペプチドをスクリーニングする実験を開始した。現在、スクリーニングを繰り返しおこなっているところである。
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