2016 Fiscal Year Research-status Report
新規多次元淘汰法によるタンパク質連結構造体形成を可能にするペプチドリガーゼの創製
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15K13313
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
一木 隆範 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (20277362)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ペプチドリガーゼ / タンパク質アレイ / 酵素改変 / Sortase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内の高効率・高収率な生化学反応ネットワークを人為的に再構築することはバイオエンジニアリングの重要目標の一つである。その実現のため、生化学反応を担う様々なタンパク質を人工的に設計、配置し生化学反応ネットワークを構築するデバイスが期待されている。しかし、タンパク質を、その機能を保ったまま思い通りに配置、集積化する技術は確立されていない。グラム陽性菌由来のタンパク質転移酵素であるSortaseは、あるペプチド配列同士を選択的に連結することから、任意のタンパク質同士の連結や、タンパク質を固相に固定化するためのツールとして用いられている。現在、連結できるペプチド配列は一組しかないが、認識配列の異なるペプチドリガーゼ改変体を複数種開発できれば、複数タンパク質の連結制御や基板上への集積化などの高度な分子操作が可能になると考えられる。そこで、本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、その効果を実証する。昨年度までに、Sortaseによって、無細胞合成したタンパク質がペプチド連結反応の基質となりうることを液相反応において確認している。本年度は、Sortaseによる無細胞合成タンパク質を固相上に固定化する技術の開発を行った。ガラス基板上をシランカップリング剤によってアミノ化し、Fmocでアミノ基を保護したオリゴグリシンペプチド基質をカルボジイミド架橋反応によって修飾し、Fmocを脱保護することにより、オリゴグリシンペプチド基質修飾ガラス基板を作製した。蛍光修飾ペプチド基質とSortaseの混合液をオリゴグリシンペプチド基質修飾ガラス基板上に滴下し反応させることで、蛍光修飾ペプチド基質がガラス基板上に固定化されることが確認でき、Sortaseによるタンパク質固相化に適用できるオリゴグリシン修飾ガラス基板の作製法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画していたオリゴグリシンペプチド修飾基板の作製法およびペプチドの固相化によるコンセプト実証を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
Sortaseによる無細胞合成タンパク質の基板上への固相化反応の検討を進めるとともに、Sortase改変体の淘汰方法についても検討を進める。
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