2017 Fiscal Year Annual Research Report
Creation of peptide ligase that enables protein-linked structure formation by novel function screening method
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15K13313
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
一木 隆範 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (20277362)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ペプチドリガーゼ / タンパク質アレイ / 酵素改変 / Sortase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、その効果を実証する。昨年度までに、ペプチドリガーゼSortaseによるタンパク質固相化に適用できるオリゴグリシン修飾ガラス基板の作製法を確立した。本年度は、タンパク質の無細胞合成反応と、無細胞合成されたタンパク質の基板上固定化反応のカップリング技術を開発した。小麦胚芽由来無細胞翻訳系にSortaseを添加することにより、緑色蛍光タンパク質(GFP)の無細胞合成と、無細胞合成されたGFPにペプチド基質を付加するSortase反応が1液中で進行することを確認した。しかし、その連結効率はSortaseの至適反応条件と比べ10倍以上低かった。これは、小麦胚芽由来無細胞翻訳系に添加されているEGTAがSortase反応に必須のカルシウムイオンをキレートするためと考えられた。次に、無細胞合成とSortase反応のカップリングによる無細胞合成タンパク質の固相上固定化反応を試行した。その際、無細胞合成するタンパク質としてリン酸化酵素を用い、固相上に固定化された酵素の活性を観測し、固相化の有無を判断した。また、連結効率向上のため、Sortaseおよびそのペプチド基質を酵素に融合させるとともに、EGTAが添加されていない無細胞翻訳系であるPUREsystemを用いた。オリゴグリシンを修飾した固相担体存在下でSortase/ペプチド基質融合酵素を無細胞合成した後、固相担体上の酵素活性を観測したところ有意に触媒活性を示し、タンパク質の無細胞合成とSortaseによる固相化が為されたことを確認した。これらの知見を無細胞合成タンパク質のマイクロアレイ化に発展させることで、連結活性の向上や認識ペプチド配列の改変を指標にしたSortase変異体のスクリーニング技術の開発に繋がるものと考えられる。
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