2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞内RNA-Proteinナノ構造体の設計法の開発
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15K13314
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤田 祥彦 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (60589266)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | RNA switch / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、昨年度に引き続き細胞内に存在する特定のRNA(miRNA)に応答して
細胞死を引き起こすシステムの構築を目指し、miRNAに応答してタンパク質の翻訳がONになるRNAの作製を行った. miRNAに応答して翻訳がONになるシステムは構築できたもののOFFからONへの活性化の度合いが小さく、細胞内に導入したRNAがすべてmiRNAに応答しているかどうか検証する必要が出てきた. miRNAによりターゲットの配列が切断されているかどうかRT-PCRにより検証を試みたが、切断は確認されなかった. これは、RNAをカチオン性脂質とのコンプレックスとして導入しているが、この場合細胞内ではエンドソーム内にトラップされるため、添加したRNAの一部のみしかmiRNAと相互作用して切断されないことが原因であると考えられる。細胞全体からRNAを回収するとエンドソーム内にトラップされたRNAも回収されバックグラウンドとして検出され、切断されているかどうかが判別できなくなっていると考えられる。現在、RNAの導入法と回収法を検討している.
今後は、前年に引き続きin vitroでの構造の観察と導入を行う予定である. また、修飾塩基によりタンパク質とRNAの結合が影響を受けることも確認されたため、修飾塩基の影響についても調査をすすめる.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
細胞内で導入したRNAについて構造や切断状態を判別しなければならないが、導入したRNAのみを回収する方法の検討に時間がかかっている. また、導入する細胞死遺伝子の種類によって細胞死誘導の効率が異なるため、これについての検討にも時間がかかっている。RNAに結合させるタンパク質(L7Ae及びその融合タンパク質)については、純度の高い精製方法を確立した.
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質は用意できているので、細胞外でのRNPナノ構造構築および、AFMの観察を行い、その後細胞内へ導入する. 機能が細胞内miRNAによって制御できることを示す予定である. また、細胞内のncRNAと相互作用することで構造変化するRNA構造について、進行が遅れているので設計および細胞内導入をなるべく早く行う.
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| Causes of Carryover |
細胞内に正しく導入されたRNAのみを回収する方法を検討することに手間取っており、AFMの観察が遅れ次年度にずれ込むため. また、前研究室からAFMのカンチレバーを譲渡された分があるため、カンチレバー購入費が予想より低くなったため.
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
AFMの実験については計画通り行い、費用が浮いた分は細胞実験に当てることで実際の細胞内での構造に関するデータの取得を増やすことにする予定である. また、継続してiPS細胞の培養を行うのでその試薬類に当てる予定である. 更に、修飾塩基による影響を検討するため、数種類の修飾塩基の購入を計画している.
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