フェムト秒レーザーによるタンパク質結晶成長モードの時空間制御

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K13380
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 森 勇介 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90252618)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (40346185) ; 吉川 洋史 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (50551173)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 光プロセシング

Outline of Annual Research Achievements

有効なドラッグデザインのためにはタンパク質分子の立体構造の解明が必須であるが、それを実現させるには構造解析に足る高品質なタンパク質結晶が必要である。申請者らは、フェムト秒レーザーをタンパク質結晶の表面に直接照射することで、結晶の成長機構を高品質化に有利とされている「渦巻き成長機構」へ転換できる技術を高度化し、高品質かつ大型なタンパク質結晶の育成技術の開発を目的とする。本技術は申請者らによって世界で初めて見出されたものである。これまでに開発してきたフェムト秒レーザーによる結晶核発生技術と組み合わせることで、タンパク質の核発生から成長までをレーザーで一貫制御することを目指して研究を行った。
平成27年度は特に、鶏卵白リゾチームの正方晶結晶表面に渦巻き成長丘を誘起可能なレーザー照射条件および溶液の過飽和条件（σ：濃度に対応）に関して成果を得た。現時点で最適なレーザー照射方法は、集光点をある程度走査する集光走査という方法である。また、渦巻き成長の誘起にはレーザー照射総パルス数が重要であり、今回検証したσ=～2.8程度の過飽和条件において、照射総パルス数が4000パルス程度の走査が結晶表面に単独の渦巻き成長丘を発生するのに最適であることが分かった。一方、パルス数が少なすぎると渦巻き成長は発生せず、照射総パルス数が大きすぎる（例えば～20000パルス）と、結晶表面に多数の微結晶が晶出し、結晶が多結晶化してしまうことも明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

鶏卵白リゾチーム（HEWL）をモデル物質として用い、正方晶結晶の{110}面に渦巻き成長を誘起可能なレーザー照射条件および溶液の過飽和度条件を検討した。
結晶へのレーザー照射方法としていくつかの照射方法（結晶表面への直接集光、集光点の走査、レーザーによって生じたキャビテーションバブルを衝突させるなど）を試みた。その結果、レーザーを結晶表面近傍に、集光走査する方法が最も渦巻き成長誘起に適していることが分かってきた。また、レーザーを集光走査する際のパワーおよびパルス繰り返し周波数を最適化する必要性も明らかになった。パルス数が少なすぎると渦巻き成長は発生せず、照射総パルス数が大きすぎる（例えば～20000パルス）と、結晶表面に多数の微結晶が晶出し、結晶が多結晶化してしまう。今回、σ=～2.8程度の過飽和条件において、照射総パルス数が4000パルス程度の走査により、結晶表面に単独の渦巻き成長丘を発生可能であることが明らかになった。また、この適切な照射総パルス数は、溶液の過飽和度に依存してシフトすることも明らかになった。これらは当初の計画どおりの進行であり、よって評価を２とする。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度には、本技術で渦巻き成長した結晶について欠陥のキャラクタリゼーションを行う。また、タンパク質構造解析にとって最重要である、X線構造解析分解能への影響も評価する。
結晶の欠陥評価は、実験室内の結晶表面観察装置とKEKなどの放射光施設を併用して行う。はじめに、結晶の大部分を渦巻き成長機構で成長させた結晶を作成する。この結晶の表面をごく微小量溶かすことで、結晶内部に取り込まれている不純物の密度や、結晶欠陥の密度を見積もる。次に、同様にして得た結晶をKEKにおいてX線トポグラフィ観察し、結晶内部の欠陥の同定を行う。これまでの研究により、技術的には、鶏卵白リゾチームのX線トポグラフィ観察によって結晶の欠陥密度を評価可能となっている。また、最終的には、共同研究者らとの連携により、SPring8におけるX線構造解析を行い、通常育成したタンパク質結晶と、本技術によって成長機構を制御して育成したタンパク質結晶の品質（最高分解能など）比較を行う。
これに加え、別のタンパク質に対しても本技術が適用可能かどうかについても調査を進めていく。

Causes of Carryover

より計画的な研究遂行のため、必要試薬類を次年度購入する方針に変更したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

28年度において、上記の試薬品等購入に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Growth of high-strength protein crystals with nanofibers (2016)
  • Author(s): M. Matsuoka, K. Kakinouchi, H. Adachi, M. Maruyama, S. Sugiyama, I. Nakabayashi, H. Tsuchikura, A. Kuwahara, S. Sano, H. Y. Yoshikawa, Y. Takahashi, M. Yoshimura, H. Matsumura, S. Murakami, T. Inoue, Y. Mori, K. Takano
  • Journal Title: Applied Physics Express Volume: Vol.9, No.3 Pages: 035503-1-3
  • DOI: http://doi.org/10.7567/APEX.9.035503
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A crystallization technique for obtaining large protein crystals with increased mechanical stability using agarose gel combined with a stirring technique (2016)
  • Author(s): M. Maruyama, Y. Hayashi, H. Y. Yoshikawa, S. Okada, H. Koizumi, M. Tachibana, S. Sugiyama, H. Adachi, H. Matsumura, T. Inoue, K. Takano, S. Murakami, M. Yoshimura and Y. Mori
  • Journal Title: Journal of Crystal Growth Volume: - Pages: -
  • DOI: -
• [Presentation] フェムト秒レーザーアブレーションを用いた成長機構転換によるタンパク質結晶の高品質化 (2016)
  • Author(s): 冨永勇佑, 林佑紀, 中山智詞, 丸山美帆子, 高橋義典, 吉川洋史, 吉村政志, 杉山成, 安達宏昭, 高野和文, 村上聡, 松村浩由, 井上豪, 森勇介
  • Organizer: 第63回応用物理学会春季学術講演会
  • Place of Presentation: 東工大 大岡山キャンパス, 東京
  • Year and Date: 2016-03-21
• [Presentation] フェムト秒レーザーアブレーションによる有機・タンパク質結晶成長の空間制御 (2016)
  • Author(s): 吉川洋史
  • Organizer: 第5回次世代の物質科学・ナノサイエンスを探る
  • Place of Presentation: ニセコ国際会議施設, 北海道
  • Year and Date: 2016-01-08
• [Presentation] ゲル化タンパク質溶液への攪拌操作による結晶核発生数の制御 (2015)
  • Author(s): 丸山美帆子, 林佑紀, 吉川洋史, 岡田詩乃, 杉山成, 小泉晴比古, 橘勝, 安達宏昭, 松村浩由, 井上豪, 高野和文, 村上聡, 吉村政志, 森勇介
  • Organizer: 第45回結晶成長国内会議(NCCG-45)
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館, 北海道
  • Year and Date: 2015-10-20
• [Presentation] フェムト秒レーザーを用いた成長機構転換によるタンパク質結晶の不純物取り込み低減 (2015)
  • Author(s): 冨永勇佑, 丸山美帆子, 吉川洋史, 杉山成, 高橋義典, 安達宏昭, 松村浩由, 高野和文, 村上聡, 井上豪, 吉村政志, 森勇介
  • Organizer: 第45回結晶成長国内会議(NCCG-45)
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館, 北海道
  • Year and Date: 2015-10-20
• [Presentation] ゲル化タンパク質溶液へのフェムト秒レーザー集光による核発生の空間制御 (2015)
  • Author(s): 山形眞, 丸山美帆子, 冨永勇佑, 吉川洋史, 杉山成, 岡田詩乃, 高橋義典, 安達宏昭, 高野和文, 村上聡, 井上豪, 松村浩由, 吉村政志, 森勇介
  • Organizer: 第45回結晶成長国内会議(NCCG-45)
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館, 北海道
  • Year and Date: 2015-10-20
• [Presentation] Effects of a Forced Solution Flow on The Step Advancement on {110} Faces of Tetragonal Lysozyme Crystals (2015)
  • Author(s): M. Maruyama, G. Sazaki, H. Adachi, M. Yoshimura, and Y. Mori
  • Organizer: The Joint Conference of 6th International Symposium on Physical Sciences in Space (ISPS-6)
  • Place of Presentation: 同志社大学, 京都
  • Year and Date: 2015-09-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ゲル化タンパク溶液におけるフェムト秒レーザー誘起核発生の空間制御 (2015)
  • Author(s): 山形眞, 丸山美帆子, 冨永勇佑, 吉川洋史, 杉山成, 岡田詩乃, 高橋義典, 安達宏昭, 高野和文, 村上聡, 井上豪, 松村浩由, 吉村政志, 森勇介
  • Organizer: 第76回応用物理学会秋季学術講演会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場, 愛知
  • Year and Date: 2015-09-14
• [Presentation] フェムト秒レーザーアブレーションを用いたタンパク質結晶成長初期における成長機構転換 (2015)
  • Author(s): 冨永勇佑, 丸山美帆子, 吉川洋史, 杉山成, 高橋義典, 安達宏昭, 松村浩由, 高野和文, 村上聡, 井上豪, 吉村政志, 森勇介
  • Organizer: 第76回応用物理学会秋季学術講演会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場, 愛知
  • Year and Date: 2015-09-13
• [Presentation] SPIRAL GROWTH OF PROTEIN CRYSTALS INDUCED BY FEMTOSECOND LASER ABLATION (2015)
  • Author(s): Y. Tominaga, M. Maruyama, H. Y. Yoshikawa, Y. Hayashi, S. Nakayama, Y. Takahashi, S. Sugiyama, H. Adachi, H. Matsumura, K. Takano, S. Murakami, T. Inoue, M. Yoshimura, and Y. Mori
  • Organizer: 20th American Conference on Crystal Growth and Epitaxy (ACCGE-20)
  • Place of Presentation: Big Sky, Montana, USA
  • Year and Date: 2015-08-03
  • Int'l Joint Research