2015 Fiscal Year Research-status Report
新規拡散係数測定装置の開発および生体分子反応ダイナミクスへの応用
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15K13623
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中曽根 祐介 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00613019)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ストップトフロー / タンパク質反応 / 過渡回折光子法 / 過渡吸収 / 分子間反応 / 高速混合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
拡散係数は分子の大きさや溶媒との相互作用に依存し、溶質分子の物性をよく反映する物理量である。蛋白質においてもその構造や会合状態の変化によって拡散係数が顕著に変化することが明らかになっており、蛋白質全体の動きを捉える上で有用な指標になりつつある。本研究では拡散係数測定に有効な光誘起過渡回折格子法を発展させ、簡便で精度が高く、また光励起を要しない測定手法の開発を行っている。さらにこの技術を独自に開発するストップトフローシステムと組み合わせることで、従来は困難であった光反応性を持たない蛋白質の反応検出を目指している。
本年度は上記目標を達成するため、新規なストップトフロー装置の開発を主に行った。既存のシステム(RX2000)はサンプル消費量が多く（１２０マイクロリットル）、貴重な蛋白質試料の測定には不向きであったため、第一にサンプル消費量の低減を目指した。また蛋白質反応を実時間でモニターするために、時間分解能の向上も同時に行った。具体的にはTジャンクション型マイクロ流路を混合場として用い、流路径を小さくすることで一度の混合に必要なサンプル消費量を２マイクロリットル以下に抑えることを達成した。しかし、一般にマイクロ流路中の流体は層流状態になりやすく二液の混合は起こりづらい。そこでコンプレッサーとプランジャポンプを併用し高圧力で送液を行った結果、乱流が生じ混合効率が飛躍的に高まることをハイスピードカメラによる撮影で確認した。送液のON/OFFは１ミリ秒以下のデッドタイムで開閉可能な高速バルブによって制御しており、全てを一つのコンピュータで制御できる再現性の高いシステムを構築した。さらに混合セル内に設けた測定窓を用いて吸収・蛍光測定を行い、システムの装置応答関数や混合速度の見積もりを行った。これまでに混合後１ミリ秒程度の時定数で起こる化学反応を捉える事に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
一年目の計画通り、ストップトフロー装置の開発を達成した。一度の測定に必要なサンプル消費量は２マイクロリットルであり、これは当初の目標を大きく上回っている。またハイスピードカメラにより混合過程を動画撮影し、ミキシングポイントから測定窓までサンプルが移動する時間は140マイクロ秒であることがわかった。またその間に混合がほぼ完了していることも確認できており、従来装置の性能を大きく上回るシステムの開発に成功した。また混合バルブやストップバルブの開閉タイミングを細かく制御することで、少量試料のミキシングであっても混合比を一定に保つことを達成した。以上から当初予定していたよりも質の高いシステムが開発できたため、計画以上に進展したと評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は多孔スリットから縞状の蛋白質溶液噴射を溶媒中で行い、これによって形成される過渡的な回折格子の消滅過程（蛋白質分子の拡散過程）を回折光強度の時間変化として検出するという独自の手法開発を行う。既にテスト実験は始めており、格子状スリットから溶液を噴射した結果、回折光は得られるものの再現性の良いデータ採取には至っていない。これは恐らく噴射に伴う乱流の発生が原因であるため、流体シミュレーションを用いて乱流を抑えるべく最適な噴射速度・スリット幅を検討する予定である。その後、実験でシミュレーション結果を検証し、適切な系が明らかになり次第様々な分子の拡散係数測定に着手する。
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| Causes of Carryover |
ストップトフローシステム開発に必要な経費が予定より抑えられたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
流体シミュレーションソフトの購入や蛋白質試料の購入に使用する予定である。
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