2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞表層から細胞内への共鳴エネルギー移動を利用したレセプター間の相互作用解析
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15K13728
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
末田 慎二 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 准教授 (00325581)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / 細胞膜レセプター / FRET / テルビウム錯体 / GFP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず本年度はまずテルビウム錯体からGFPへの細胞表層でのFRETを利用したレセプターの相互作用解析を行った。具体的には、レセプターとしてGPCRの一種であるブラジキニンB2レセプター（B2R）を選び、B2R間のホモ会合体の形成を解析した。ここではB2Rを細胞表層においてテルビウム錯体とGFPでラベル化するために、B2RのN末端にBCCPを連結した融合タンパク質（BCCP-B2R）とGFPを連結した融合タンパク質（GFP-B2R）の発現プラスミドを作成した。作成した発現プラスミドを利用して、両融合タンパク質を動物細胞上に発現させ、その後、テルビウム錯体で修飾したBPL（Tb-BPL）を作用させて、B2Rをテルビウム錯体でラベル化した。ラベル化処理後、細胞からの蛍光をプレートリーダーで測定し、FRETを評価した。ここでコントロールとしてGFP-BPLの代わりに、N末端にFLAGタグを連結したB2R（FLAG-B2R）を利用して同様に解析を行った。その結果、解析の当初はコントロールの系おいても、FRETに由来する520 nm付近の蛍光が観察され、コントロールとの差を明瞭に観察することができなかった。しかし、測定溶液に含まれる成分を見直すことにより、コントロールではほとんどFRETが観察されない条件を見つけることができた。この条件下ではBCCP-B2RとGFP-B2Rを共発現させた系においてのみ顕著なFRETが観察され、B2Rが生細胞においてホモ会合体を形成していることが確認できた。また同様の測定系を別のGPCRであるアンジオテンシンIIタイプ１レセプター（AT1R）についても構築し、この系についてもAT1Rがホモ会合体を形成することを示すデータを取得することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生細胞系に発現させた細胞膜レセプターについて、テルビウム錯体からGFPへのFRETを利用した測定条件について検討を行い、レセプターの会合に由来しないFRETを極力抑えた測定条件を見出すことに成功した。また、細胞膜レセプターのB2Rに関して、細胞表層でのテルビウム錯体からGFPへのエネルギー移動を利用した相互作用解析系を構築し、B2Rがホモ会合体を形成することを示すことに成功した。さらに、別の細胞膜レセプターであるAT1Rについても同様にホモ会合体を形成することを示すことができた。これらより研究はおおむね順調に進展しているものと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に得られた知見を元に、まずB2RのN末端とC末端にそれぞれBCCPとGFPを連結した融合タンパク質（BCCP-B2R-GFP）を利用して解析を行う。BCCP-B2R-GFPを動物細胞上に発現させた後、Tb-BPLを作用させてテルビウム錯体でラベル化を行う。この系についてテルビウム錯体からGFPへのFRETをモニターすることにより、細胞膜を介したエネルギー移動効率について詳細に検討する。また、ここでは時間分解蛍光測定を行うが、その最適な測定条件についても調査する。その後、細胞膜を介したエネルギー移動を利用して、B2Rの会合挙動の解析を試みる。ここではBCCP-B2Rと共に、B2RのC末端にGFPを連結した融合タンパク質（B2R-GFP）を動物細胞に発現させ、Tb-BPLを作用させてテルビウム錯体によるラベル化を行う。ラベル化後、テルビウム錯体からGFPへのFRETをモニターすることにより、ホモ会合体の形成を解析する。初年度に得られた細胞表層でのFRET分析で得られた値と比較して、B2Rの会合状況にどのような違いが見られるか検証する。また、B2Rだけでなく、AT1Rについても同様に解析を行う。さらにB2RとAT1Rはヘテロ会合体を形成することも知られているため、この現象の観察も試みる。ここではAT1RのN末端にBCCPを連結した融合タンパク質（BCCP-AT1R）とB2R-GFPを共発現させた細胞についてテルビウム錯体で処理した後、細胞膜を介したFRETをモニターすることにより解析を行う。一方でこれらレセプターの会合はそれぞれのアゴニスト（ブラジキニンやアンジオテンシンII）の添加により影響が出ることも知られているため、構築した解析系を利用して、アゴニストの添加効果についても検証する。
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