2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of protein crystallization tag using crystalline lattice
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15K13747
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
真板 宣夫 徳島大学, 先端酵素学研究所(次世代), 准教授 (00404046)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | タンパク質結晶構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は論文投稿と、特許出願の２点にプロジェクト注力した。投稿論文としてまとめる際に一種類の成功例だけだとインパクトに欠けることと、特許審査においても汎用性を主張するため、ユビキチン以外での例が必要と考えた。そこで新たに低分子のタンパク質を融合させたもコンストラクトを作製した。
具体的には、免疫に関与する機能・構造未知のドメイン（260残基）、ミトコンドリア融合に重要であるMFN2のＣ末端にある機能・構造未知のモチーフ（108残基）を新たに作製し、大腸菌で発現・精製を行った。どちらも収量は良くなかったが、これまでの方法で結晶化を行うには十分な量が取れ、シーディング法で結晶化を行ったが、結晶は得られなかった。
また、R1ENのＣ末の融合体だけでなく、Ｎ末での成功例も欲しいと考え、Ｎ末にSumoを融合させたもの（Sumo-R1EN）を作った。従来通りの方法でSumo-R1ENの結晶は得られたものの、Ｘ線データを解析したところSumoの電子密度は得られなかった。
さらに、この手法を複合体構造解析に利用することを目指し、ユビキチン、Sumoそれぞれに結合するモチーフとの融合タンパク質を作製した。具体的にはUIM-R1EN-Ub、Sumo-R1EN-SIMの2種類で、R1ENのＮ末とＣ末にそれぞれタンパク質を融合させたものを作製した。UIM-R1EN-Ubは収量が低かったが、Sumo-R1EN-SIMはR1EN-Ubと同程度取ることが出来た。従来通りの方法で結晶化を行ったが、３ヶ月経った現在もまだ結晶は得られていない。
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