2016 Fiscal Year Research-status Report
化学的スプライシングによる機能性核酸および細胞機能の制御
| Project/Area Number |
15K13749
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
井原 敏博 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (40253489)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | ターピリジン / アントラセン / 化学的スプライシング / 金属イオン / 光二量化 / DNAzyme活性制御 / DNAの構造制御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
DNAコンジュゲートの合成
非天然の構造をDNA骨格中に組込むためには、まずそれらの構造を基体とするアミダイト試薬を合成する必要がある。ターピリジンを骨格とするアミダイト試薬を合成し、前年度までにterpy2DNAの合成に成功した。DNAzymeの活性制御に関する基礎的な検討を行っていたが、シークエンスを変更して合成を行った。
ant2DNAについてはアントラセンをアミダイト化して自動合成装置にて合成した。いずれのコンジュゲートに関しても導入するターピリジンやアントラセンをDNA部分と繋ぐリンカーの長さの異なるいくつかのものを合成した。常法にしたがって逆相HPLCで精製し、MALDI-TOF MSで同定した。
Ω型構造形成に関する検討
terpy2DNAについては、UV融解実験によりΩ型形成に伴うその基本性能の変化を確認することができた。本年度はこれを金属イオンをトリガーとするペルオキシダーゼ活性を持つDNAzymeの活性制御を行った。いくつかの遷移金属イオンに関して検討したが、中でもCu2+やNi2+を添加した際に著しい活性の増大を確認することができた。また、EDTAの添加、およびターピリジンに挟まれたシークエンスに相補的なDNAを添加した際にはその活性は完全に失われることもわかった。これはターピリジンの錯生成能を反映したものであり、意図したとおりDNAの構造を制御してDNAzymeの活性をコントロールできたことを示している。
ant2DNAについては、光照射によって分子内でアントラセンの光二量化反応が進行してΩ型構造をとることを確認することができた。リンカー長に依存することがわかったので異なるリンカー長をもつアントラセンアミダイトを合成し同時に系統的にその反応性を評価した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していた細胞系への適用を年度内に行うことができなかったが、これは研究の遅れではなく、terpy2DNAを用いたDNAzymeの系が当初考えていたよりも面白い性質を示したために金属イオンの範囲を広げて検討を行ったためである。
terpy2DNAのΩ型構造形成を利用して塩基配列を編集することに成功した。すなわち、遷移金属イオンとの作成により骨格中に導入した二つのターピリジンユニットに挟まれた部位をバイパスして外側に位置する二つの塩基配列を連結することができた。これは、可逆的な化学的スプライシングとみることもできる。これまでになかった全く新しい概念に基づく手法であるため、この研究成果は非常に注目され、幾つかの新聞に取り上げられた。
ant2DNAに関しては、現在までは予定通り実験が進みリーズナブルな結果を得ている。すなわち、Ω型構造形成はアントラセンとDNAを結ぶリンカー長に影響を受け、光照射の際にant2DNAが１本鎖構造であったか、あるいは、アントラセンの外側、あるいはループ部分と相補鎖との２本鎖構造を形成していたかで反応をオンオフ制御することができる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
機能性核酸の活性制御
terpy2DNA にならって、ant2DNAを用いてペルオキシダーゼ活性を有するDNAzymeを使用し、その活性制御を検討する。まず、DNAzymeを２つに分割（スプリット）して不活性化する。光反応によるΩ型構造形成（スプライシング）によりはじめて有効なテンプレートが生じ、これにより活性なDNAzymeが再構成される。ant2DNAに関しては、申請者は、DNA末端に導入したantの光二量化反応（4π-4π）が高効率、可逆的に進行し、チミンの関与する2π-2π型の光架橋とは直交する選択性の高い反応であることを既に報告している。
遺伝子発現の制御
terpy2DNAおよびant2DNAは刺激に応答してDNAあるいはRNAと特異的に結合する。特にantの二量化は、申請者オリジナルの、いわゆるbioorthogonalで、しかも可逆的な反応である。スプライシング後にΩ型アンチセンス配列を与えるant2DNAを用いて、まず無細胞系で、次に細胞内で光によるGFP（緑色蛍光タンパク）の発現制御を試みる。また、逆反応によりRNAをリリースさせ、RNAi機構を発動させることにも挑戦する。さらに、o型DNA形成を利用して転写因子が結合する安定な二本鎖をin situで生成させ、これをデコイ核酸として転写制御に用いる。
|
