2016 Fiscal Year Research-status Report
低分子二重特異性抗体の機能的な構造の解明に向けた既存抗ペプチド抗体の結晶化抗体化
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15K14227
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 良和 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (20374225)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低分子二重特異性抗体は、次世代抗体医薬として期待されているが、実用化された例は海外で1件のみであり、機能的なシーズをデザインするための技術基盤が未整備、特に立体構造情報が欠落していることに一因がある。構造解析に向けては結晶化抗体の利用が考えられるが、新たな抗体の取得は容易ではなく、また汎用性もない。本研究は、既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドを低分子二重特異性抗体に含まれるリンカーに組み込むことで、当該特異的抗体を結晶化抗体として利用し、その機能的な構造を解明することを目的としている。
今年度は、前年度選別した抗体－抗原ペプチドの共結晶構造情報をもとに、実際に当該ペプチドをリンカーに挿入した低分子二重特異性抗体Ex3と当該ペプチド特異的抗体の全合成、および調製へと進めた。まず、ペプチド特異的抗体の遺伝子配列を発現宿主である大腸菌に至適なコドンに置換した配列を設計し全合成後、大腸菌分泌発現ベクターに挿入した。大腸菌を形質転換後、Western blottingにより発現確認を行った結果、菌体内不溶性画分、菌体内可溶性画分、および培地上清画分のいずれにも発現している様子が確認された。続いて、菌体内可溶性画分から金属キレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行った結果、目的分子量に一致した精製度の比較的高いタンパク質バンドが観察されたため、ペプチド特異的抗体の調製に成功したといえる。一方、大きく形態の異なる2種類のEx3のリンカーにペプチド配列を挿入した分子を設計し、PCRにより、それぞれ発現ベクターを作製した。今後、ペプチド特異的抗体と同様に、発現確認、精製へと進め、機能評価を行う予定であり、それぞれ結果が良好であれば、ペプチド特異的抗体との複合体を作製し、結晶化へと進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度までに、アクセスビリティが高いことや、対応する特異的抗体の親和性が高いこと、など様々な観点からリンカーに組み込む抗原ペプチドの選定を進め、最終的に、精製・検出に用いられる抗ペプチドタグ抗体を2種類含む5種類のペプチド-抗体複合体を選別した。本年度は、まず選別したペプチド特異的抗体の遺伝子配列を発現宿主である大腸菌に至適なコドンに置換した配列を設計し全合成後、大腸菌を用いた組換え発現を行った結果、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製に成功した。一方で、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した分子に関しては、形態が異なる2種類の分子を作製したが、発現確認を行った結果、従来の培養法では、菌体内不溶性画分での発現はみられたものの、菌体内可溶性画分や培地上清画分などの可溶性画分にはほとんど発現がみられなかった。このため、培地組成など培養条件の検討を行う必要性が生じ、前述の新たに調製したペプチド特異的抗体との複合体の作製に基づく、結晶構造解析に進むことが出来ず、未使用額が生じ期間延長を行ったため、やや遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した2種類の分子形態に関して、可溶性画分からの調製を目指した培養条件検討を進める。Western blottingにより、菌体内可溶性画分、あるいは培地上清での発現を確認後、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製へを進める。ペプチド特異的抗体に関しては、前年度までに比較的高純度での精製に成功している。当該ペプチド配列を挿入したEx3の調製に成功し次第、それぞれを混合後、実際に結晶化へと進める。一方で、高い安定性と高い発現量を期待して、ラクダ科由来のシングルドメイン抗体をペプチド特異的抗体として最終的に選択している。結果期待通りに調製することに成功したが、結晶化を促すかは未知数である。これまでに、抗ペプチドタグ抗体を2種類含む5種類のペプチド-抗体複合体の選別をデータベース等により行っているため、状況に応じて、他のペプチド特異的抗体の利用も視野に入れて進める。全合成後、さらに当該ペプチド特異的抗体が認識するペプチドをリンカーに挿入したEx3を作製し、それぞれ同様に発現ベクターを作製、組換え体の調製、および結晶化へと進める予定である。
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| Causes of Carryover |
独自に開発してきた低分子二重特異性抗体Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した分子に関して、形態が異なる2種類の分子を作製したが、発現確認を行った結果、従来の培養法では、菌体内不溶性画分での発現はみられたものの、菌体内可溶性画分や培地上清画分などの可溶性画分にはほとんど発現がみられなかった。このため、培地組成など培養条件の検討を行う必要性が生じ、新たに調製したペプチド特異的抗体との複合体の作製に基づく、結晶構造解析に進むことが出来ず、未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度に引き続き、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した2種類の分子形態に関して、可溶性画分からの調製を目指した培養条件検討を進める。Western blottingにより、菌体内可溶性画分、あるいは培地上清での発現を確認後、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製へを進める。リンカーを改変させたEx3の調製に成功次第、ペプチド特異的抗体との複合体を作製し、結晶化へと進める。前年度、未使用額に関しては、主にリンカーを改変させたEx3の培養条件検討に用いる消耗品に充当する予定である。
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