2017 Fiscal Year Annual Research Report

Development of antibodies for crystallization based on anti-peptide antibody to elucidate the functional structure of small bispecific antibodies

Research Project

Project/Area Number	15K14227
Research Institution	Tokyo University of Agriculture and Technology
Principal Investigator	浅野竜太郎東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中良和東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	癌 / バイオテクノロジー
Outline of Annual Research Achievements	低分子二重特異性抗体は、次世代抗体医薬として期待されているが、実用化された例は海外で1件のみであり、機能的なシーズをデザインするための技術基盤が未整備、特に立体構造情報が欠落していることに一因がある。構造解析に向けては結晶化抗体の利用が考えられるが、新たな抗体の取得は容易ではなく、また汎用性もない。本研究は、既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドを低分子二重特異性抗体に含まれるリンカーに組み込むことで、当該特異的抗体を結晶化抗体として利用し、その機能的な構造を解明することを目的としている。前年度に引き続き、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した2種類の分子形態に関して、可溶性画分からの調製を目指した培養条件検討を進めた。結果、内1種類に関しては培養上清への分泌が確認されたため、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製を行ったが、目的蛋白質を高純度で得ることが出来なかった。そこで、菌体内不溶性画分を塩酸グアニジンで可溶化後、巻き戻し操作による調製を試みた行った結果、リンカーにペプチド配列を挿入した可溶性のEx3分子の調製に成功した。そこで、前年度までに可溶性画分からの調製に成功しているラクダ科由来の抗ペプチドシングルドメイン抗体と混合させ、複合体形成の有無をゲル濾過により確認した。結果、明確な複合体の形成はみられず、また電気泳動によりリンカーにペプチド配列を挿入したEx3分子の明瞭なバンドが確認できなかったため、リンカーの改変により凝集体が形成されたと考えられた。分子としての安定性を維持するようなペプチド配列の選択や挿入場所の検討が必要であることが示された。