2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14228
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
梅野 太輔 千葉大学, 大学院工学研究科, 准教授 (00400812)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河合 繁子 千葉大学, 大学院工学研究科, 助教 (40638920)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | プレニル化酵素 / イソプレノイド / カロテノイド / 進化分子工学 / 局在化 / 大腸菌 / セレクション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は，既知／未知問わずさまざまなテルペン酵素の細胞活性をコロニー色でスクリーニングする手法を確立してきた。本研究では，これらの手法を転用して，いままで不可視であったプレニル期タンパク質/ペプチドのプレニル化合成酵素の細胞活性を、ハイスループットに色スクリーニングする手法を開発するのが目的である。その手法を用いて、(1)タンパク質のプレニル化活性の向上，(2)標的特異性の改変・多様化・そして特異化に挑むのと，ここで得たプレニル化システムを用いてさまざまな酵素・タンパク質活性の時空間制御が目的である。
その初年度であるH27年度は，その下ごしらえとして，プレニル転移酵素のスクリーニング系の確立を目指した（項目１）。その活性進化実験には至らなかったが，酵母からのタンパク質プレニル化酵素系の大腸菌への移植，タンパク質の局在を顕微鏡にて確認する系の確立に成功した。
一方で，酵母のタンパク質プレニル活性は常に基底状態に保たれている。これらのタンパク質プレニル化活性の大腸菌への安定な移入，そしてその活性の任意なON/ Off制御には，更に上位において，きっちりon/off制御する必要がある。そのための遺伝子発現系を自家開発することに成功した。
来H28年度は，本H27年度に開発したすべての要素技術を結集し，いよいよ，プレニル化経路の大腸菌での試運転と改良にはいる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
[項目1] プレニル転移酵素のスクリーニング系の確立を行った。人工／天然のカロテノイド経路を用いて，それぞれC15, C20, C25骨格のプレニル二リン酸の消費活性を可視化できるようになった。これを用いれば，それぞれのサイズのプレニル基転移酵素の細胞活性を選択的にスクリーニングできる。
[項目2] 酵母からタンパク質プレニル化酵素系をなす遺伝子を大腸菌に導入し，その発現を確認することに成功した。また，蛍光タンパク質のカルボキシル末端にプレニル化タグとなる４アミノ酸を融合した結果，その膜への局在を，蛍光顕微鏡およびウエスタン解析によって確認・観察する系の確立に成功した。
[項目3] 酵母のタンパク質プレニル活性は常に基底状態に保たれている。これらのタンパク質プレニル化活性の大腸菌への安定な移入，そしてその活性の任意なON/ Off制御には，プレニル転移酵素そのものの発現を，外的な刺激でon/off制御する必要がある。そのための緊縮性の高い遺伝子発現系を，トリプトファン誘導系，およびコリン誘導系の改造によって，自家開発することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本H27年度において，本研究の完遂に必要な要素技術はほぼすべて揃えることができた。H28年度には，ここで開発したすべての要素技術を結集し，いよいよ，プレニル化経路の大腸菌での試運転と改良にはいる予定である。具体的には，(1)プレニル化酵素の構造遺伝子，あるいは標的タンパク質のプレニル化タグへのランダム変異の導入によって，ライブラリを作製する。(2) カロテノイド色スクリーニング系あるいは，ネガティブセレクタを用いたカウンター選択系を用いて，より活性の高い（あるいは新規活性を得た）変異体を取得する。(3) それらの遺伝型および表現型をin vitro解析するとともに，GFP-tagを用いた顕微鏡観察を行い，その新規活性を実証する。
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