2015 Fiscal Year Research-status Report
新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質開発技術の確立
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15K14229
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
久堀 徹 東京工業大学, 資源化学研究所, 教授 (40181094)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光蛋白質 / 細胞内環境 / リアルタイム可視化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛍光顕微鏡技術の発達により、細胞内の観察が非常に容易になってきている。一方、細胞内に存在する代謝産物などの低分子化合物については、必ずしもモニターが簡単になったわけではない。本研究では、我々が最近成功した環境応答型蛍光タンパク質の開発実績を踏まえて、細胞内の様々な代謝産物の増減をリアルタイムで直接モニターすることの出来る新規細胞内環境モニター蛍光タンパク質を開発するための技術を確立する。これによって、すでに開発されている細胞内ATPやcAMPのFRETによる測定系を超越する実験系を完成し、ROSやNADPH等の酸化還元物質、グルタチオンやATP,GTPなどの生体分子の変動をリアルタイムにモニターすることを目指す。そこで、本研究では、次の二項目について研究を実施している。①酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、我々がすでに開発した酸化状態で蛍光が急激に消光する蛋白質Oba-Qをベースとして、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を行っている。初年度は、アンテナとなる蛋白質のスクリーニングを実施する。②生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、グルタチオン、および、その他の生理活性低分子について親和性を持ち蛍光が変化する蛋白質の作成を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
①酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、酸化還元に関わる細胞内低分子と電子の授受を行う蛋白質をOba-Qに融合することで、新規にこれらの細胞内低分子の検出することが出来るシステムの開発を目指した。酸化還元応答蛍光蛋白質として実績のあるroGFPで成功例のあるグルタチオンペルオキシダーゼを融合した蛍光蛋白質では、活性酸素に対する明確な蛍光感受性を得られるが、その他の蛋白質を用いた活性酸素検出形の確立には到っていない。一方、酸化還元応答蛍光蛋白質自体の開発については、新規に酸化還元に応答することによって蛍光色が変化するユニークな蛋白質の単離に成功した（特許出願準備中）。②生体内低分子を検知して蛍光が変化する蛋白質のスクリーニングについては、まだ適切な候補蛋白質を得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
①酸化還元物質を検知して蛍光が変化する新規蛋白質の開発では、引き続き蛍光変化を最大限に引き出すことの出来るアンテナ蛋白質の探索を行う。また、平成27年度までに作成に成功した蛍光色の変化する新規酸化還元応答蛋白質と活性酸素結合蛋白質の融合蛋白質を作成し、細胞内の酸化還元電位の変化をより詳細に測定することの出来る実験系の確率を目指す。また、蛋白質の構造変化と蛍光変化の関係に着目し、より簡便に、かつ、高感度に生理活性低分子の存在をリアルタイムモニターする系の開発を行う。
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