神経の微細観察系を新たに構築し、アンジェルマン症候群の病理解明を目指す研究

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14338
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 海老原 達彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (00344119)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 神経発生 / 神経病理学 / エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

アンジェルマン症候群は、重篤な発達遅滞を主症状に持つ、原因染色体領域・遺伝子が特定されている疾患である。原因遺伝子がUbe3aと分かっていることから、先天性疾患の中では研究を進めやすい部類と考えられる物の、分子レベルの病理解析は立ち後れている。一方、疾患が重篤であることから、治療効果を少し上げるだけでも、患者と家族のQOL上昇を見込むことが出来る。本研究では、この疾患の分子メカニズム解明を最終目的として、その端緒として細胞レベルでの発症の再現ひいては病態モデル動物の構築を目指す。同時にその病態の可視化を目指す。そのために、以下二とおりの流れで研究を進める。
適切な神経観察系の構築：マウスの海馬錐体細胞を胎児から培養し、核内遺伝子の可視化を目指す。FISHでの染色系を確立した上で、超解像顕微鏡での撮像を目指す。サンプルの厚さ、遺伝子の局在部位によっては困難が予想されるので、並行して大気圧走査電子顕微鏡による観察も目指す。
モデルマウスの作製：Ube3aの遺伝子発現状況を可視化する、AS疾患モデルマウスを作製する。
次に、健常動物の錐体細胞のUbe3a発現阻害による疾患の再現を行う。また、モデルマウスから海馬錐体細胞を培養し、その神経シナプス形成過程を経時的に観察することで、発達異常に関する知見を得る。将来的に、この培養レベルでの神経回路形成異常の分子レベルでの解析を進めることで、治療可能性を模索したい。また、このマウスはUbe3a発現状態をモニターできるように作製する。このマウスを用いて発現状態改善のための治療手段についても、並行して解析していく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

核内の観察を実現できていない。プローブの設計を、再検討している。大気圧走査電子顕微鏡による観察は、分裂期の染色体の観察は出来ているが、平時のクロマチン観察の条件を詰め切れていない。
モデルマウス作製について、ES作製が難航した後、人工染色体組み込みを検討した。結局それも頓挫してしまい、現在、TG作成手法を用いて、ゲノム編集による相同組み換えに挑戦している。
総じて遅れてしまっている。

Strategy for Future Research Activity

仕事内容の見直しにより、昨年度から、研究への注力を増やす事が出来てきている。研究者として、今後もアンジェルマン症候群を研究していきたく思っており、そのための足がかり形成のためにも、今年度を真摯に取り組みたい。
核内観察について、ASEMによる観察を優先させる。核内のクロマチン染色方法を比較するため、蛍光顕微鏡と画像パターンを見比べつつ、ASEMで何が見えているのか、検討していく。
モデルマウス作製について、ゲノム編集を用いた現在の作製手法にて、確立を急ぐ。

Causes of Carryover

モデルマウス作製を、人工染色体導入によって行うことにして、計画を進めていたが、コスト面の問題から難航してしまい、計画が遅れてしまった。結局ゲノム編集による作製に切り替えて、現在進めている。更に業務内容のバランス上、本課題に注力しきれず、上記トラブルの間、他の培養実験などを進める余力がなかった。
結果、全体の研究進行が遅れてしまい、予算の使用も滞ることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在ゲノム編集によるマウス作製を行っている。こちらは実際に作業が進んでおり、それに伴いマウス作製経費として、消耗品として使わせていただく。
仕事バランスの見直しを更に進め、本研究に今年度注力できるように調整している。確保した時間を初代培養細胞を用いた解析を進めることにして、関連の消耗品に予算を使わせていただく。使い切りありきではなく、必要なところに使わせていただくように留意しつつ、研究を行う。

Research Products

• [Journal Article] Development of new fusion proteins for visualizing amyloid-β oligomers in vivo. (2016)
  • Author(s): Ochiishi T, Doi M, Yamasaki K, Hirose K, Kitamura A, Urabe T, Hattori N, Kinjo M, Ebihara T, Shimura H.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 66 Pages: 316, 323
  • DOI: 10.1038/srep22712
  • Peer Reviewed / Open Access