2016 Fiscal Year Research-status Report
ゼブラフィッシュを用いたMuRFの発現機構解析と筋萎縮治療薬の探索
| Project/Area Number |
15K14341
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Medical University |
|---|
Principal Investigator |
川原 玄理 東京医科大学, 医学部, 講師 (40743331)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 由起子 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (50238135)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | 筋萎縮 / MuRF1 / ゼブラフィッシュ / 薬剤スクリーニング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMuRF-1の発現をコントロールする薬剤のスクリーニングのため、ゼブラフィッシュのmurf1プロモーター領域を特定し、マイクロインジェクションによるトランスジェニックフィッシュの作製を行った。その結果、murf1 遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域、約600塩基対がmurf1プロモーター領域として、その発現制御に重要であることが明らかになった。その領域の配列を上流領域に組み込んだEGFP発現ベクターを用いてトランスジェニックゼブラフィッシュを作成することに成功した（F0）。これらの個体を成魚まで成長させ、野生型と交配し次世代（F1）を作成し、F１個体群からGFP陽性を示す個体をスクリーニングした結果、骨格筋、心筋特異的にGFPシグナルが観察される個体、つまりGFPシグナルにより間接的にmurf1の発現が観察される個体が得られた（F1）。これらのmurf1 トランスジェニックフィッシュを用い、murf1の発現に影響を及ぼす薬剤を見いだすため、GFPシグナルを指標とした薬剤スクリーニングを行い複数の候補薬剤を得ることができている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
骨格筋、心筋特異的にGFPのシグナルが観察されるトランスジェニックフィッシュが得られこのトランスジェニックフィッシュの系統を確立した（F1）。作製したmurf1トランスジェニックフィッシュを用いて、murf1の発現制御物質のスクリーニングを行った。1,250個の薬剤を含む薬剤ライブラリーを用いたスクリーニングの結果、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する複数の薬剤が得られた。現在のところ計画通り達成されているが、得られた複数の薬剤の効果についてのさらなる確認実験を現在行っているため、やや計画からは遅れていると自己評価している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
得られた薬剤群が及ぼすmurf1の発現への効果を定量的PCR、ウエスタンブロッティング解析法により、murf1トランスジェニックフィッシュを用いた結果と同様な結果が得られるかどうかを確認する。それらが確認された候補薬剤を用いて、筋萎縮を表すモデル動物を用いてその効果を評価していく。
|
| Causes of Carryover |
次年度、得られた薬剤群が及ぼすmurf1の発現への効果を定量的PCR、ウエスタンブロッティング解析法により確認が必要であることと、国外で行われる学会への参加、国際誌への論文の投稿が、次年度使用額を生じた理由である。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
使用計画としては、発現解析に用いる実験試薬の購入の他に、国外で行われる国際学会への参加費（参加登録費、旅費等）、国際学術誌への投稿料を予定している。
|
