2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14344
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
白尾 智明 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20171043)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GAP 結合 / ドレブリン / コネキシン / アストロサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GAP 結合機能のオン・オフに関与するドレブリン－コネキシン連関が直接的結合なのか、間接的な結合なのかを明らかにするために、本年度は、まず培養細胞内においてコネキシン43 とドレブリンEの結合を検証する系を作成した。myc タグ付きドレブリンEとHAタグ付きコネキシン43、CMV-EGFPをHEK細胞に種々の条件で遺伝子共導入し、蛍光顕微鏡により導入効率を検討した。また、ドレブリンのコネキシンの結合はGAP結合の活性化を誘導することが知られているので、遺伝子共導入した場合とCMV-EGFPの単独遺伝子導入した場合の、GFP蛍光像を比較したが、著明な相違はなかった。次に、遺伝子共導入したHEK細胞のライゼートをウェスタンブロットで解析した。抗mycマウスモノクローナル抗体（9E10）、抗mycラビットポリクローナル抗体及び抗ドレブリンモノクローナル抗体（M2F6）のいずれを用いても同程度の感度で、myc タグ付きドレブリンEを特異的に検出することができた。同様に、抗HAラットモノクローナル抗体（3F10）、抗コネキシン43ラビットポリクローナル抗体及び抗リン酸化コネキシン43ラビットポリクローナル抗体（S368）のいずれを用いても同程度の感度で、HAタグ付きコネキシン43を特異的に検出することができた。次に、アストロサイトを用いて同様の実験を行った。アストロサイトでは抗ドレブリン抗体、抗コネキシン抗体を用いた場合は、myc タグ付きドレブリンEやHAタグ付きコネキシン43に加えて、内在性のドレブリンEおよびコネキシン43を検出することができた。最後に、抗mycマウスモノクローナル抗体（9E10）を用いて、免疫沈降法によりmyc タグ付きドレブリンEおよびその結合タンパク質を回収する系を開発した。この系を用いて、現在ドレブリンEとコネキシン43の結合部位の解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
免疫沈降法でドレブリンとコネキシンの共沈降を調べる際に、種々のバッファーにより検出感度が大いに変わるので、バッファーの選択をするのに予定以上の時間を必要とした。また、ドレブリンと結合しないコネキシンと結合しているコネキシン４３の分子量が異なっていることが示唆されたため、その違いの詳細を再検討する必要が出現した。以上の理由により、実験の進行がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、平成27年度に決定したバッファーを用いた系を使うことにより、当初の研究計画に従って、ドレブリン－コネキシン結合が、ドレブリンのリン酸化・脱リン酸化により制御されるかどうかを明らかとしていく。さらに、ドレブリンのリン酸化がアクチン細胞骨格を介してGAP 結合機能のオン・オフと関与している可能性を解析する。実験の遅れを取り戻すために、実験に用いる細胞培養の作成頻度を上げて対応する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成27年度は予定していた細胞培養補助者が採用できなくなった。また、実験の進行がやや遅れてしまったため、予定していた海外学会での発表ができなくなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に予定した海外学会での成果発表を平成２８年度に行う。また、細胞培養補助者を新規採用する予定である。また、平成27年度の実験の遅れを取り戻すために、細胞培養の頻度を上げて対応するため、物品費が多くかかるが、当初の請求分を超える部分を、次年度使用額で賄う予定である。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] A novel role for drebrin in regulating progranulin bioactivity in bladder cancer2015
Author(s)
Xu SQ, Buraschi S, Morcavallo A, Genua M, Shirao T, Peiper SC, Gomella LG, Birbe R, Belfiore A, Iozzo RV, Morrione A.
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Journal Title
Oncotarget
Volume: 6
Pages: 10825-10839
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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