2017 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the molecular basis of neural stem cell niche using synthetic polymer arrays
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15K14346
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
田賀 哲也 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (40192629)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 神経幹細胞 / ニッチ / 自己複製 / シグナル伝達 / 発生・分化 / ポリマー / 神経科学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経幹細胞の微小環境（ニッチ）の分子基盤確立による神経幹細胞の自己複製機構解明に挑んだ。これまでに合成ポリマーアレイスライドと蛍光解析による自己複製評価系を海外研究協力者と開発して、神経幹細胞ニッチの機能を有するポリマーを同定することで研究を進めた。376種類の合成ポリマーをスポットしたスライド上にマウス胎仔終脳由来の神経幹細胞を培養して未分化マーカー等を蛍光解析し、神経幹細胞に未分化性を維持させる神経幹細胞ニッチ擬態ポリマーPA518および対照となる未分化性に寄与しないポリマーPA531を得て、PA518ポリマーに特異的に結合する蛋白質の回収実験に着手した。予想外にもスケールアップしてディッシュにコートしたPA531ポリマーが細胞接着性を示さなくなり、再度探索して対照ポリマーPA417を選定するまでに時間を要し、PA518ポリマー結合蛋白質の回収実験が今年度にずれ込んだ。
今年度はPA518とPA417をスケールアップしてコートしたディッシュの上に、胎生14.5日目のマウス終脳細胞をFGF2存在下で4日培養して純度を上げた神経幹細胞を播種して1日培養し、ポリマー結合蛋白質の回収実験を行った。ポリマー特異的結合蛋白質の収量を増やす一方、非特異的結合蛋白質を軽減するために、細胞を剥がす条件検討を行った。細胞が十分剥がれるトリプシン反応条件で処理した神経幹細胞培養後のポリマーコートディッシュに結合した蛋白質をSDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファーで回収し、SDS-PAGEを実施してゲルを銀染色した。その結果、PA518特異的な分子量25kD以下の6種類の分子量の蛋白質の存在を示すバンドを同定することができた。同様の実験を繰り返し、類似分子量を示す6種類の蛋白質の存在を確認することができた。これにより今後質量分析による蛋白質同定をはじめとする神経幹細胞自己複製ニッチ解明へと展開が可能となった。
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