2016 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of mouse blastocyst complementation without contribution to germ cells
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15K14374
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| Research Institution | Central Institute for Experimental Animals |
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Principal Investigator |
橋本 晴夫 公益財団法人実験動物中央研究所, 実験動物研究部, 研究員 (30353478)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 胚盤胞補完法 / マウス / 生殖細胞 / 不妊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は標的遺伝子に対するshort hairpin (sh) RNAベクターを導入したES細胞の樹立を目指したが、近年のゲノム編集技術の台頭により、年度の途中からCRISPR/Cas9によるノックアウトES細胞の作成に切り替えた。さらに、ドナーであるマウスES細胞は129系統由来のES細胞にGFP発現ユニットを導入したMM8を用い、キメラを作成してみた。しかし、蛍光顕微鏡下でのGFPは微弱であったため、他の候補を模索することとした。
本年度は、CRISPR/Cas9により生殖細胞への分化に関わる遺伝子Prdm14をノックアウト(KO)したES細胞を樹立し、正常マウスへの胚盤胞へのインジェクションを実施した。Prdm14KO-ES細胞は、大阪大学から導入したGFPを発現するES細胞(EGR-G101)で相同組み換えを実施して作成した。すなわち、ターゲッティングベクターに組み込んだピューロマイシンによる薬剤耐性およびDS-Redにより組み換え体を選別した。その結果、4つのクローンを採取し、サザンブロットを行った結果、4つのクローン全ては相同組み換え体であることが明らかになった。
樹立したPrdm14KO-ES細胞をドナー、正常なIQI/Jicマウスの胚盤胞をレシピエントとし、キメラの作成を試みた。その結果、作成されたキメラの精巣および卵巣からGFPは検出されなかった。さらに、キメラの雌雄それぞれを正常なマウスの雄雌で交配させたが、雌雄ともに次世代の獲得はできなかった。これらの結果からPrdm14遺伝子をノックアウトしたES細胞はキメラの生殖細胞へ寄与せず、不妊になることが明らかになった。
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Research Products
(4 results)
