2015 Fiscal Year Research-status Report
ナノポアシークエンサーを用いた不明熱病原体ゲノムの同定
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15K14417
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 穣 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山岸 潤也 北海道大学, 人獣共通感染症センター, 准教授 (80535328)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム / 簡易型シークエンサー / 熱帯感染症 / 迅速診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、MinIONを用いて不明熱患者血清における未同定病原性微生物の同定を行う方法論的開発を行うものである。デングウイルス、B型肝炎ウイルス、マラリア原虫感染血清を各10検体づつモデル試料に用い（試料は入手済み）、MinIONシークエンスによってそれぞれの病原体が検出可能であるかを検証する。血清からRandom Primer-MDA法を用いてゲノム全体を増幅し、シークエンスアダプター反応を行った後にMinIONを用いて塩基配列を決定する。反応は乾燥化試薬を用いて等温反応で行い、反応生成物の精製は磁気ビーズを用いて2段階のみ行う。産出された塩基配列を用いて相同性検索を行うことで病原体を同定する。最終的には病原体未同定のインドネシア不明熱患者血清10検体を用いて現地でシークエンスによる病原体の同定を行い、その実行可能性の試験までを視野にいれる。
今年度、デングウイルス、B型肝炎ウイルス、マラリア原虫感染血清については、モデル系での解析を行うことができた。またバーコード配列を利用した多検体化の検討を行い、実用化に成功している。引き続き、実験系の頑強性についても検出を行おうと考えている。また、デング、マラリアについては、該当する情報解析パイプラインを整備することができた。これらについては、今年度中の論文化を検討している。
また、MDA法によるランダムな核酸増幅系についての予備的検討も並行して行った。来年度以降の検討に向けて、核酸増幅効率およびヒト由来核酸の除去方法について、検討方針を決定するのに重要な予備的データを取集することができたと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初目的として設定していた、MinIONシークエンサーを用いてデングウイルス、B型肝炎ウイルス、マラリア原虫感染血清について、モデル系での解析を行うことができた。十分な感度と精度で検出を行う実験系を確立することができたと考えている。またバーコード配列を利用した多検体化についても検討に成功、運用を開始している。一方で、肝炎ウィルスについては、当初、予定していた試料の品質が十分でなく、検証を行うことができなかった。引き続き、生物種への拡張性について、基礎的な実験データの収集が必要であると考えている。また、デング、マラリアについては、該当する情報解析パイプラインを整備することができた。これらについては、今年度中の論文化を検討している。
また、MDA法によるランダムな核酸増幅系についての予備的検討も並行して行った。こちらについては、モデル化合物を用いても、シークエンス反応に用いるに十分な増幅を確認することができず、抜本的な実験系の再構築の検討が必要であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
より多くの検体を用いて、昨年度までに確立された実験系の再現性、頑強性を検証する。実用化に向けて、野外への普及を促進するために東南アジア地域での実地試験を行う。デングウィルスの型別判定、熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性関連遺伝子については、一定の成果を上げることが可能であると考えている。
一方で、MDAを用いたランダムな核酸増幅については、昨年度の予備的検討から相当の困難がともなうことが予想される。MDA法に限らず、他の核酸増幅法を検討し、簡便かつ頑強な増幅系の確立に努める。また契沖からヒト由来核酸を効率的に除去する実験系の検討も開始する。不明病原体の核酸解析にむけての実験系についても、今年度、その技術基盤にある程度のめどを立てたいと考えている。
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