2015 Fiscal Year Research-status Report
一塩基同定・一分子定量精度をもつゲノムワイド非コードRNAデジタル計数法の開発
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15K14425
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
城口 克之 国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (00454059)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シークエンス / デジタル計測 / バーコード |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、独自に開発した“分子バーコーディング”法の標準化を目標に、低コスト化と同時に測定分子数のダイナミックレンジの拡大を行ってきた。この方法は、polyAが付加しているRNAを対象に行ってきたが、本研究では、その測定対象の範囲をpolyAが付加していないRNAに拡張することを目的としている。この技術により、一塩基の精度で配列を同定でき、一分子の分解能で定量計測できる技術の世界標準化を目指している。
polyAが付加していないRNAの最初の測定モデルとして、small RNAを対象にしている。small RNAは20塩基程度であり、polyAのように共通配列を持たないため、分子バーコードをligation反応で付加して、ターゲット配列と分子バーコード配列を１対１対応させる。その後増幅して、同じターゲット配列をもつ分子に対する分子バーコード配列の種類を計数する。これにより、バーコード配列が付加した増幅前の分子の絶対数を定量できる。この時、同じバーコード配列を持つ分子は同じ分子から増幅されたことを意味するので、ターゲット配列に増幅エラーやシークエンスエラーがあっても、増幅された複数の分子の配列から、多数決の原理で増幅前の配列を高精度に決定することができる。
ここで重要なのは、分子バーコード配列をターゲット配列に結合させる効率である。まず、20塩基程度の合成RNAを購入し、その3'に一本鎖DNAを結合させることを試みた。特異的に結合させるために、一本鎖DNAの5'末端をアデニレート化し、アデニレーションに特異性を持つ酵素を用いてRNAの3'へライゲーションした。様々な条件で反応を行いゲルで確認したところ、安定して50%程度のRNAに一本鎖DNAを結合させることができた。この結果は、次の段階への大きな一歩となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RNAに対する一本鎖DNAの付加について安定した結果を得るために時間を要したが、最終的によい結果を得られた。次のステップへ進むことができるという点では、よい進捗となっている。一方で、昨年度中に線形増幅反応にトライしたいと思っていたので、その点を考慮して「やや遅れている」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
・バーコードを付加したRNAの線形増幅を行う
・cDNAを環状化して増幅する。もしくは、RNAの5'側にアダプターを付加して増幅する。
・シークエンスを行う
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| Causes of Carryover |
「現在までの進捗状況」に記したように、予定していた第二ステップの反応まで達成できなかったので、それに伴う試薬の購入などをしなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
第二ステップの反応をテストするための試薬の購入などに使用する。
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