2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞内異常蛋白質凝集体を効率よく分析できるプロテオミクス新手法の開発
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15K14427
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| Research Institution | 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群) |
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Principal Investigator |
市村 徹 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工, 応用科学群, 教授 (50213012)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹清 貴浩 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工, 応用科学群, 准教授 (00545981)
八谷 如美 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 主任研究員 (30408075)
田岡 万悟 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (60271160)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | プロテオミクス / 質量分析 / アグリゲート / トリプシン消化 / 固相抽出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
難溶性タンパク質の可溶化には、ギ酸や塩酸グアニジンなどの変性剤やSDSやTriton X-100などの界面活性剤が汎用されている。しかしながら、これらの可溶化剤は、トリプシン消化やLC-MS分析の前に、十分に希釈または完全に除去する必要がある。この操作は、一般に時間を要し、かつサンプルロスを引き起こすため、本研究課題にあるような微量タンパク質凝集体の分析に適用することはできない。そこで、今年度は、これらの可溶化剤の存在下でも十分にLC-MSの高感度分析ができるように、システムの条件整備を行った。
上記溶剤を含むタンパク質溶液から逆相クロマトグラフィーの疎水性ビース担体を使用してタンパク質を回収濃縮し、ビーズをバッファーで洗浄後（界面活性剤の場合はアセトンも使用）、有機溶媒を含む溶液中でトリプシン消化を行う方法を開発した。モデルタンパク質としてウシ血清アルブミン(BSA)とウマ筋シトクロームＣ(CytC)を用いた試料溶液を同方法で分析した結果、すべてのサンプルから効率よくBSAとCytCの消化ペプチドが回収・同定できることが分かった。また、本方法は、従来の溶液内トリプシン消化では分析が困難であったμＭ以下の試料濃度のBSAとCytCにも効率よく適用できることが明らかとなった。実際、本方法を高濃度の塩酸グアニジンに溶解した線虫(C. elegans)１匹のプロテオーム解析に応用した結果、線虫タンパク質を再現よく、また偏りなく分析できることが確認された。本方法は、微量な難溶性タンパク質を簡便、かつ効率よく前処理できる新しいプロテオミクスプラットフォームになると結論した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の研究で、熱凝集させた卵白タンパク質を高濃度に可溶化できる溶媒を開発した。この溶媒は変性効果があるため、トリプシン消化のためには同溶媒を除去する工夫が必要になることを指摘した。今年度の研究において、疎水性ビーズ担体を使用することで、ギ酸、塩酸グアニジンやＳＤＳなどが混入したタンパク試料から直接トリプシン消化・LC-MS分析ができる方法を開発することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に開発した可溶化溶媒と今年度に開発した分析システムを融合させることで、微量なタンパク質凝集体でも効率よく分析できるプロテオミクス新手法の開発を行う。また、今年度に開発した分析手順をチップ先端に固定した疎水性ビーズ担体を用いて行えるようにする。これにより、実験操作がより簡単になるとともに、実験者間でのデータのばらつきも低減することが予想される。また、これにより、実験のハイスル―プット性も向上することが期待される。
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| Causes of Carryover |
今年度の研究において、疎水性ビーズ担体を使用することで、ギ酸、塩酸グアニジンやＳＤＳなどが混入したタンパク試料から直接トリプシン消化・LC-MS分析ができる方法を開発することができた。しかし、次年度に計画している実験（延長願いを申請したもの）が残っており、これを行うための予算が残った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
昨年度に開発した可溶化溶媒と今年度に開発した分析システムを融合させることで、微量なタンパク質凝集体でも効率よく分析できるプロテオミクス新手法の開発を行う。また、今年度に開発した分析手順をマイクロチップの先端に固定した疎水性ビーズを用いて行えるようにする。これにより、実験操作がより簡単になるとともに、実験者間でのデータのばらつきも低減できることが予想される。また、これにより、実験のハイスル―プット性も向上することが期待される。これらを行うために、予算を使用する。
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