2017 Fiscal Year Annual Research Report

A new proteomics sample processing method of intracellular insoluble aggregates

Research Project

Project/Area Number	15K14427
Research Institution	防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群)
Principal Investigator	市村徹防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 教授 (50213012)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	竹清貴浩防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 准教授 (00545981) 八谷如美地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 主任研究員 (30408075) 田岡万悟首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (60271160)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	プロテオミクス / 質量分析 / アグリゲート / トリプシン消化 / 固相抽出
Outline of Annual Research Achievements	細胞内に形成される微量なタンパク質凝集体を、迅速かつ高感度でプロテオミクス解析するためのサンプル調製法はまだ十分に整備されていない。我々は昨年度までの研究で、（１）今日最も難溶と考えられている熱凝集卵白タンパクでも極短時間に高濃度で可溶化できる新しい可溶化溶媒システムを開発した。また、（２）逆相クロマトグラフィー用の疎水性マイクロビーズ担体に目的タンパク質を吸着・濃縮した後で、有機溶媒を含む溶液中でトリプシン消化を行う新しいタンパク質消化法を開発した。そこで今年度は、これらの二つの研究手法を組み合わせること、またこれまでに明らかした結果の一部を論文として公表した。熱凝集した卵白タンパクを（１）の可溶化溶媒を用いて可溶化した。可溶化した卵白タンパクを（２）のマイクロビーズ表面に吸着させた。ビーズをバッファーとアセトンを用いて洗浄し（１）の可溶化溶媒を完全に除去した後で、60％アセトニトリルを含むバッファー中でトリプシン消化を行った。消化物はLC-MSe分析することでタンパク質を同定した。その結果、本法は熱凝集した卵白凝集体を超高感度にプロテオミクス分析できることが明らかとなった。また本法は、従来まで解析することができなかった線虫 (C. elegans)１匹に形成される老化凝集体の解析にも非常に有効であることが確認できた。一方、これらの研究を行っている過程で、（２）のタンパク質消化法（BOPs法と命名）をACS Applied Materials & Interfacesに発表した。