2015 Fiscal Year Research-status Report
高感度変異検出法の開発を目指した多能性幹細胞ゲノム維持機構の解明
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15K14430
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| Research Institution | The University of Kitakyushu |
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Principal Investigator |
日高 京子 北九州市立大学, 基盤教育センター, 教授 (00216681)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / DNA修復 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多能性幹細胞におけるゲノム維持機構を解明するには関連する遺伝子の機能解析が必須である。ミスマッチ修復に関わるタンパク質はDNA修復のみならず、細胞のアポトーシス誘導にも必要であり、多能性幹細胞のゲノム維持機構において大変重要な役割を果たしていると考えられるが、アポトーシス誘導にいたるまでの詳細なメカニズムは不明である。そこで今年度はCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりミスマッチ修復タンパク質・MSH2の遺伝子変異導入を行った。
MSH2はMSH3およびMSH6とヘテロダイマーを形成することによってDNA鎖上の誤対合を認識し、スライディングクランプへの構造変化を経て下流の修復タンパク質群を動員する。この構造変化はATP依存性であり、MSH2のATPaseドメインの遺伝子点変異は大腸がんを多発する遺伝性疾患Lynch syndromeでも報告されている。マウスにおいてATPaseドメインにあるG674の変異はミスマッチ修復能の消失をもたらすもののアポトーシス誘導能は損なわないと報告されており、DNA修復とアポトーシス誘導の重要な分岐点を捉えていると考えられてきた。一方、近年のゲノム編集技術の著しい発展により、受精卵のみならず培養細胞においても比較的容易に変異を導入することが可能となった。多能性幹細胞はDNA修復能力が高く一般にゲノム編集効率が低いとされているため、まずはHeLa細胞を用いてゲノム編集技術の導入を行った。ハイスループットにも対応したPCRによるスクリーニング系を確立し、合成オリゴ一本鎖DNAをドナーとして用い、薬剤選択なしで変異クローンを効率良く選択することができるようになった。この結果、Lynch syndromeで知られる変異、G674RおよびG674D変異を導入することに成功した。現在はこれらの変異細胞についての解析を進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、多能性幹細胞のゲノム安定性維持機構としてミスマッチ修復系の関与に着目し、鍵となる経路・因子を同定し利用することを目的としており、今年度当初の計画ではミスマッチ修復経路の阻害因子をスクリーニングする予定であった。しかしながら、まずはミスマッチ修復経路がゲノム維持機構にどの程度重要な役割を果たしているか、さらには個々のタンパク質の機能はどのようであるかを、マウスではなくヒト細胞で十分に解析することがより重要であろうということにより、若干の軌道修正を行った。ゲノム編集技術の導入は順調に進んでおり、このため自己評価を「おおむね順調に進展している」とした。多能性幹細胞における解析については培養条件の検討をはじめ現在準備を進めている段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は変異細胞を用いてMSH2タンパク質の機能解析、ヘテロ二量体におけるパートナータンパク質MSH3, MSH6との相互作用、タンパク質安定性に及ぼす影響、ミスマッチ結合およびリリース能、ミスマッチ修復能などのin vitroでの解析を進める一方で、突然変異頻度、細胞死誘導解析などin vivoでの解析を進める予定である。また、これまでに解析したクローンのほとんどにおいて、デザインした点変異は１つのアレルに導入され、残りのアレルは欠失または付加による欠損というヘテロ接合変異体であったが、野生型アレルを１つ残した状態で変異を導入するための条件検討を行う。さらに、多能性幹細胞への変異導入を行うため、より効率の高いゲノム編集技術の確立、条件の最適化を試みる。
MSH2をはじめとするミスマッチ修復の遺伝子の変異は大腸がんを多発するヒト遺伝性疾患Lynch syndromeにおいて多数報告されているほか、散発性大腸がんでも報告されている。しかしながら、タンパク質の構造と機能にさほど重大な変化を及ぼさない遺伝子多型（バリアント）が健常人においても報告されており、これが多能性幹細胞の長期にわたる細胞の継代による変化にどのような影響を及ぼしうるか不明である。今回確立したゲノム編集技術は効率の高いバリアントの作製法の開発につながり、バリアント解析を通して多能性幹細胞の質を維持するためのメカニズムについて重要な知見が得られると期待される。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗状況を見ながら、必要な消耗品をその都度発注したため次年度へのずれが生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ハイスループット解析に必要なマルチチャンネルピペットやマルチウェルプレート等の購入に当てる予定である。
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