種間遺伝学的相互作用解析法の確立と宿主-微生物相互作用研究への適用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14437
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 佐藤 昌直 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科, 特任助教 (20517693)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 種間遺伝学的相互作用 / DNAバーコード / アンプリコンシークエンシング

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究は様々な遺伝子型の宿主内での大腸菌遺伝子破壊株ライブラリー各株の増殖レベル（フィットネス）を網羅的に測定し、宿主、大腸菌間での遺伝学的相互作用（種間遺伝学的相互作用）を測定する新規手法を開発、応用することを目的とした研究である。特に約4000株存在する大腸菌遺伝子破壊株を混合した状態のまま、次世代シークエンサーを用いて一度（en masse）に測定するプロトコールを確立し、種間遺伝学的相互作用を効率よく測定できるようにすることを重点目標としている。本申請研究の採択・配分額を踏まえ、申請時の研究計画をスリム化し、平成27年度の研究として実験系の簡便化を図った。Keio Collectionではなく、DNAバーコードを遺伝子破壊マーカー遺伝子近傍に挿入したASKA bar code deletion libraryを使用した（奈良先端科学技術大学院大学・森浩禎教授との共同研究）。そして、ASKA bar code deletion libraryおよび次世代シークエンサーを用いて効率的に大腸菌遺伝子破壊株ライブラリー各株の存在比を測定するen masseフィットネスプロファイリングのプロトコールを確立し、LB培地で培養した大腸菌集団を材料に評価実験を行い、ライブラリー調製に関して良好な結果を得ている。
また、ショウジョウバエへ注射した大腸菌の存在量を東京慈恵医科大学熱帯医学講座・嘉糠洋陸教授、佐久間知佐子助教との共同研究によって検討し、en masseフィットネスプロファイリングを行う時系列点を選定し、ASKA bar code deletion libraryを注射したショウジョウバエのサンプリングを行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ASKA bar code deletion libraryのen masseフィットネスプロファイリングプロトコール作製については類似研究で確立された方法をベースにしながら、ASKA bar code deletion library特有の塩基の偏りを考慮し、プロトコールを完成させることができた。研究を展開する基盤となるプロトコールを計画通り確立することができたため、順調に進展していると評価した。ショウジョウバエ注射サンプルからのライブラリー作製を試みたが、達成に至らなかった点が計画以上の進展があったと評価できなかった点である。宿主との相互作用についての実データ取得は計画通り次年度に取り組みたい。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は宿主内に注射したASKA bar code deletion libraryサンプルに対し、これまでのプロトコールを用いてライブラリー作製を行い、種間遺伝学的相互作用を解析するための実データを取得する。基本的な研究計画の変更は無いが、宿主側の変異体数については得られる結果、生物学的な洞察を最大化できるよう費用対効果を最適化した選定を行う。
また、en masseフィットネスプロファイリングデータを元に、定量的に種間遺伝学的相互作用を解析する方法の確立に取り組む。解析対象となるデータは各バーコードDNA配列の存在比についてのデータであるため、既存の統計学的手法を組み合わせることによって種間遺伝学的相互作用を定量解析できると計画している。

Causes of Carryover

配分予算に応じた研究計画の見直しにより、平成28年度に必要となる経費を残す形での支出を行ったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

翌年度分と合わせて次世代シークエンサーを用いた解析の費用として使用し、当初の研究計画に可能な限り近い実験デザインとなるよう研究を実施する。