ショウジョウバエ始原生殖細胞の凍結保存と個体再生法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14441
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 田中 大介 基礎生物学研究所, IBBPセンター, 特任助教 (60425593)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 生物遺伝資源 / 始原生殖細胞 / 昆虫 / ガラス化 / 超低温保存 / 凍結保存 / PGC / ショウジョウバエ

Outline of Annual Research Achievements

昆虫始原生殖細胞の凍結保存に世界で初めて成功した。ショウジョウバエ受精卵は低温や凍結に対する耐性が低く、これまで実用的な凍結保存に成功した例はない。これまで発生学の研究分野において研究が進められている精子や卵子の元となる始原生殖細胞（Primordial Germ Cells: PGCs）を昆虫遺伝資源保存という観点で実験に用いた。本研究は、昆虫遺伝資源を安定的長期に保存するために、始原生殖細胞を凍結保存する技術を開発し、始原生殖細胞のホスト個体への移植により、系統を復活させる技術の確立を目指している。ショウジョウバエのドナーから始原生殖細胞をガラスキャピラリー針で単離し、最適化した凍結防御剤で処理をおこない、ただちに液体窒素に浸漬し超急速冷却させガラス化（凍結）保存した。また、急速昇温させた細胞をホスト胚へと移植した結果、凍結保存および移植に成功した。成虫まで発生したため交配したところ、移植した始原生殖細胞に由来する配偶子が生じた。
ショウジョウバエは、ゲノム情報データベース等が完備され、遺伝学的手法を用いて遺伝子機能を解析する格好のモデル生物である。しかし、多様な遺伝的変異を持つ膨大な数のショウジョウバエ系統の維持には、継代飼育をおこなう以外の有効な方策は開発されてこなかった。ショウジョウバエゲノムの突然変異系統の総数は10万を超える。系統を継代維持する過程において、経過時間とともに突然変異等の遺伝的変異が蓄積し、当初の表現型を観察することが困難になる等の問題も生じている。本研究成果は、ショウジョウバエをはじめとした昆虫遺伝資源の始原生殖細胞を凍結保存で維持できることを示唆する。将来、カイコなど我が国が有する莫大な昆虫遺伝資源への利用が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ショウジョウバエ始原生殖細胞（PGC）のガラス化法を開発した。ドナーからPGCをガラスキャピラリー針で摘出後、最適化したガラス化液で処理し、ただちに液体窒素に浸漬した。急速昇温させた細胞をホストに移植し超低温保存および移植に成功した。ホスト個体の生殖巣の細胞がドナー由来であることが確認され、移植した成虫個体同士の交配実験を行い凍結保存技術の成功が確認された。さらに、最適な凍結防御剤の種類、濃度、冷却速度，昇温速度等の条件検討をおこなった。凍結保存した細胞の移植成功率を計算したところ、通常のショウジョウバエ胚からの始原生殖細胞の単離、およびホストへの移植の成功率と大きな差は見られなかった。このことから、細胞への大きなダメージや影響は低いものと推測される。したがって汎用性の高い保存技術開発が開発できたと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

現在、凍結保存した始原生殖細胞から個体再生するために、始原生殖細胞をホスト胚へと移植し、成虫まで発生させた後に移植した始原生殖細胞に由来する配偶子が生じるかを解析している。今後、ホストとして不妊系統を用いて移植された始原生殖細胞に由来する配偶子のみが産生されるよう研究を推進する。この方法により、移植したホストが生産する配偶子は、ほぼ完全に移植した始原生殖細胞由来になることが実証される。
始原生殖細胞の凍結保存における生存率とガラス化液の開発、凍結保存下での水の挙動と細胞内微細構造の経時的解析を行い結果を取りまとめ発表する。また、ショウジョウバエにとどまらず、カイコなどの有用昆虫遺伝資源への応用について検討をおこなう。

Causes of Carryover

所属研究所が、本課題で雇用している技術補助員の給与の一ヶ月分を支払ったため計画していた予算に残金が出た。

Expenditure Plan for Carryover Budget

昆虫遺伝資源の凍結保存実験に用いる消耗品を購入する。