2015 Fiscal Year Research-status Report
二次的小分子RNA生成における反応モジュール間連動機構の解明
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15K14444
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岩川 弘宙 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (60710415)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | RNAサイレンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は, 「二次的小分子RNA生成機構」によりRNAサイレンシング複合体であるRISCの標的RNAから小分子RNAを作り出す. この機構は「RISCによる標的RNAの認識と切断」「RNA依存性RNAポリメラーゼ6 (RDR6)による相補鎖合成」「DCL4による二本鎖RNAのプロセシング」の３つの反応モジュールが連動することで機能すると考えられている. これまで各モジュールを対象とした解析は進められてきたが, モジュール間の連動機構は未知である. 本研究は多因子・多段階反応である二次的小分子生成機構を試験管内で再構成し, 反応モジュール間の連動機構を生化学的, 生物物理学的に解析することで, 二次的小分子生成機構の最重要反応であるRDR6の鋳型選択機構を明らかにする.
平成27年度はショウジョウバエS2細胞発現系を用いることで高純度のリコンビナントRDR6を用意することに成功した. RDR6の活性を評価する過程で「精製RDR6はポリA鎖を3´末端にもつRNAを転写の鋳型に出来ない」という驚くべき結果を得た. この結果は, なぜポリAをもつ細胞内の内在mRNAがRDR6によって二本鎖化されず, RISCによって切断されたmRNAやウイルスなどの異常なRNAのみが二本鎖化されサイレンシングされるのか, という長年の謎を解き明かす可能性がある. さらなる解析により, RDR6は8塩基以上のポリA配列をもつRNAを転写の鋳型にできないこと, アデニン以外の連続配列を3´端にもつRNAや, 配列の内部にポリA配列を持つRNAは鋳型にできることを明らかにした.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の最終目標は二次的小分子生成機構の最重要反応であるRDR6の鋳型選択機構を明らかとする事である. 発案当初はRDR6自身に鋳型選択性はなく, RISCが標的を切断するプロセスがRDR6に基質特異性を付与すると仮定していた. しかしながら本研究で, RDR6自身に「ポリA鎖を3´端にもつRNAを転写の鋳型に出来ない」という鋳型特異性があることを明らかにすることができた. この発見により, ３つの反応モジュール全てを試験管内で再構成するという当初の計画を変更し, RDR6自体がもつ極めて特殊な鋳型選択機構に焦点をあてた.
計画こそ変更したが, RDR6の鋳型選択機構を明らかとするというゴールには大きく近づいたため, 研究は概ね順調に進んでいると評価した.
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度はRDR6の鋳型選択機構を全反射照明蛍光顕微鏡観察を通して一分子レベルで解析する. 具体的には3´末端にポリAをもつRNAまたはポリAを持たないRNAの5´末端をビオチン化し, ニュートラビジンを介してポリエチレングリコール（PEG）コーティングされたガラス基板上に固定する. RDR6はHaloやSNAPなどの共有結合性融合タグを用いることで蛍光標識する. RDR6と上記2種類のRNAとの結合頻度と結合時間をrNTPを除いた環境で一分子観察する.
またRISCでRNAを切断した場合にRDR6による相補鎖合成効率が上がるのかを生化学および生物物理学的手法を用いて解析する.
平成２７年度に試験管内系を用いて観察されたRDR6の基質特異性が in vivoでも発揮されるのかを調べるための細胞実験系を構築する.
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| Causes of Carryover |
当初, 平成２７年度に二次的小分子生成機構を試験管内で完全再構成する予定であったが, 研究の過程でRDR6自身に非常に興味深い基質特異性があることを発見したことにより計画に変更が生じたため.
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２８年度は計画書に記載した通りRDR6の鋳型選択機構を全反射照明蛍光顕微鏡観察を通して一分子レベルで解析するとともに, 平成２７年度に達成する予定であった「RISCによる標的RNAの認識と切断」モジュールと「RDR6による相補鎖合成」モジュールを繋げた試験管内系を作製する. さらに平成２７年度に発見したRDR6の基質特異性が in vivoでも発揮されるのかを調べる細胞実験系を整える. 上記プロジェクトを遂行するために平成28年度助成金と当該助成金を使用する計画である.
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