観るだけでわかるタンパク質間相互作用のハイスループット解析法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14456
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (40192679)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: タンパク質間相互作用 / GFP / Nanobody

Outline of Annual Research Achievements

共免疫沈降法をベースとして私たちが新たに開発したタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ；Visible Immunoprecipitation assay）は、GST-抗GFP-nanobodyによる免疫沈降に用いたグルタチオンセファロースビーズに結合している蛍光タンパク質（GFPやRFP）を、蛍光顕微鏡下で直接観察することによって相互作用を検出するものである。この相互作用解析法は斬新で極めて簡便であるが、ビーズを顕微鏡下で観察しなければならないために、アッセイのハイスループット化には向かないという欠点があった。そこで、本研究では、抗GFP-nanobodyをマイクロプレートに直接結合させ、蛍光プレートリーダーを用いて相互作用を検出し、アッセイをハイスループット化するための基礎研究を行った。
まず、大腸菌で発現させて調製したGST-抗GFP-nanobodyをマイクロプレートに直接固定化しようと試みたが、感度良く検出できるほどに固定化することはできなかった。そこで、京都工繊大の熊田陽一らが開発したマイクロプレートの素材に直接結合する親和性を有する何種類かのタグをGST-抗GFP-nanobodyに付加して、各種素材のマイクロプレートへの結合効率を調べた。その結果、ポリスチレンに対して高い親和性を示すタグ配列（PSタグ）を付加した抗GFP-nanobodyが、比較的高効率でポリスチレン製マイクロプレートに固定できることが明らかになった。一方、PMMA系アクリル樹脂に対して親和性を示すタグを付加した場合には、PMMAマイクロプレートに対する固定効率はあまり高くないという結果が得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記のように、PS親和性タグを付加することによって、GST-抗GFP-nanobodyをポリスチレン製マイクロプレートに比較的高効率で固定することに成功した。PSタグ付きGST-抗GFP-nanobodyは大腸菌で発現させて容易にかつ大量に調製できることから、VIPアッセイをできるだけ安価にハイスループット化するための第一段階をクリアしたと言える。したがって、本研究はおおむね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

次の段階として、PSタグ付きGST-抗GFP-nanobodyを固定化したポリスチレン製マイクロプレートへの非特異的なタンパク質の吸着を抑制するためのバッファーの条件や、ブロッキングの条件について検討する必要がある。その後は、相互作用を調べたいGFP融合タンパク質やRFP融合タンパク質を発現させた細胞の抽出液を添加した時に、相互作用をもっとも効率良く検出することが可能なバッファーなどの条件について検討する必要がある。このような条件を順次確定していくことによって、VIPアッセイのハイスループット化が可能になると考える。

Research Products

• [Journal Article] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis (2016)
  • Author(s): Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 159 Pages: 201-208
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Modulation of ciliary length by melanin-concentrating hormone receptor 1. (2016)
  • Author(s): Hamamoto, A., Yamato, S., Katoh, Y., Nakayama, K., Yoshimura, K., Takeda, S.,
  • Journal Title: Cell. Signal. Volume: 28 Pages: 572-584
  • DOI: Cell. Signal.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GM130 is a parallel tetramer in a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • Author(s): Ishida, R., Yamamoto, A., Nakayama, K., Sohda, M., Misumi, Y., Yasunaga, T. & Nakamura, N.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 282 Pages: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • Author(s): Katoh, Y., Nozaki, S., Hartanto, D., Miyano, R. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • Author(s): Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 290 Pages: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.655191
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-contain (2015)
  • Author(s): Kubo, K., Kobayashi, M., Nozaki, S., Yagi, C., Hatsuzawa, K., Katoh, Y., Shin, H.-W., Takahashi, S. & Nakayama, K.
  • Journal Title: Biol. Open Volume: 4 Pages: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] COPI-mediated retrieval of SCAP is crucial for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • Author(s): Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, S., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • Author(s): Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Lipid Res. Volume: 56 Pages: 2151
  • DOI: 10.1194/jlr.M062547
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • Author(s): 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • Author(s): 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • Author(s): 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与 (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • Author(s): Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • Organizer: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • Place of Presentation: Snowmass Village, Colorado,
  • Year and Date: 2015-07-19 – 2015-07-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • Author(s): 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • Organizer: 第67回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 草津
  • Year and Date: 2015-05-16