2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of high-throughput system of visible immunoprecipitation assay
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15K14456
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中山 和久 京都大学, 薬学研究科, 教授 (40192679)
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2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / GFP / Nanobody / マイクロプレート / ポリスチレン親和性タグ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、独自に開発した改変型共免疫沈降法である『観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法：visible immunoprecipitation assay（VIPアッセイ）』に関して、マイクロプレートによりアッセイが可能になるように改良するとともに、このアッセイを用いてさまざまな結合タンパク質のスクリーニングを行うことを目的とした。
まず、共免疫沈降に用いるGST融合型抗GFP-Nanobodyに関して、これまでの検討結果でもっとも吸着性の高かったポリスチレン（PS）親和性ペプチド配列をタグとして用い、PSマイクロプレートへの吸着条件、およびプレート洗浄の条件の最適化を図った。PSタグNanobodyは、BSAや界面活性剤のTween20の存在下においても、PSマイクロプレートに対して高い吸着性を示した。ただし、感度はグルタチオンセファロースビーズを用いる通常の共免疫沈降系と比べてはるかに悪かった。
そこで、抗GST抗体を二次抗体、抗ウサギIgGを三次抗体として用いてシグナルを増幅し、最終的にELISAで検出することを検討した。さまざまな比率で二次抗体と三次抗体を試し、最適の比率条件を決定した。そして、ELISAで検出することによって、高感度化に成功した。さらに、GST融合型抗GFP-Nanobody（一次抗体）、二次抗体、三次抗体の添加に関して、One-Step、Two-Step、Three-Step添加法を試し、One-Step法での高感度化を達成できた。ただし、ELISAを用いる方法ではVIPアッセイの利点（すなわち簡便であること）を十分には活かせていないことから、実用化のためには今後の検討が必要である。
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[Presentation] Phospholipid flippase ATP10A, a me mber of type IV P-type ATPases, translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics.2016
Author(s)
Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
Organizer
2016 ASCB Annu al Meeting.
Place of Presentation
San Francisco, California, USA,
Year and Date
2016-12-03 – 2016-12-07
Int'l Joint Research
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[Presentation] Trafficking Machineries within Cilia: Arc hitectures and Functions of the IFT-A and IFT-B complexes.2016
Author(s)
Nakayama, K., Katoh, Y., Terada, T., Nozaki, S., Hirano, T. & Funabashi, T.
Organizer
第68回日本細胞生物学会大会シンポジウム「高次生命機能を司るメンブレ ントラフィック：分子基盤からその破綻による疾患発症の理解に向けて」
Place of Presentation
京都
Year and Date
2016-06-15
Invited
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