多次元フローサイトメトリー法によるシグナル分子修飾の解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14459
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 川本 智 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教室系技術職員 (60457116)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩崎 哲史 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 助教 (40379483)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: フローサイトメトリー / 細胞内シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

本研究は多次元フローサイトメトリー法（細胞内シグナル伝達分子の動態と細胞生理現象の複数パラメータについてフローサイトメーターを使用して同時に測定する手法）の確立を目的としている。H28年度は1. １次元フロー（フローサイトメトリー解析）法の確立、2. 解析ソフトウェアの開発、3. モデル系生物を用いた多次元フロー法による解析 を予定していた。1. のうち、遺伝子発現測定法に関しては、RNAプローブによるチューブ内 in situ hybridizationについての検討を行った。RNAプローブはH27年度に報告したLNA (Locked Nucleic Acid) プローブに比べ、作成に関してコスト的、時間的に有利なため、今後の多次元フロー解析への展開を考えて使用を検討した。In vitro転写法を用いてRNAプローブを作成し、標的遺伝子の発現を特異的に検出することができたが、多次元解析では通常のIn situ hybridizationと異なり、タンパク質の分解を抑えつつ、プローブを細胞内に取り込ませて標的RNAとハイブリダイズさせることが必要となる。そのため、ハイブリダイズのバッファー組成、温度、洗浄の条件の組み合わせを試行することで、遺伝子発現の検出及びタンパク質リン酸化レベルの変動の検出の同時解析（２次元フロー解析）を行うことができた。現在、より高い検出感度で２次元フロー解析を行うための至適条件を検討中である。2. については、H27年度で報告した３パラメータのグラフ化について、入出力のインターフェースの改善を行うとともに、時間軸のパラメータを加えたグラフ化の追加を検討している。3. については、ヒト メラノーマ細胞WM98-1系統において、従来法を用いて得られた遺伝子発現解析、タンパク質リン酸化レベルの解析、それぞれの結果との比較検討を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

多次元フロー法のうち、遺伝子発現解析法は他の解析法と組み合わせて行う基本的な解析法であるため、本研究において極めて重要である。そのため、多次元フロー法を確立するにあたってH27年度に確立した手法に加え、より汎用性の高い手法であるRNAプローブの作成、条件検討を行ったため、当初予定していた多次元解析への展開がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

H29年度は引き続きヒトメラノーマ細胞WM98-1系統を用いて、遺伝子発現解析とタンパク質リン酸化レベルの２次元解析を行うための至適条件を検討、確立し、さらに細胞生理現象のパラメータ（ミトコンドリア活性測定法、細胞内局在測定法）を加えた多次元解析について、具体的なデータ示して成果報告を行う予定である。一定の成果が得られれば、他のモデル生物での検証を行う。解析ソフトウェアの開発については、得られたデータを実際に作成したソフトウェアに取り込み、評価したうえで、多次元のパラメータを適切に加工、出力できるように試行する。

Causes of Carryover

試薬の購入額に満たなかったため、次年度に購入することにした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

少額であるため、次年度分と合わせて必要試薬の購入を行う。