2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K14461
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
増本 博司 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 講師 (80423151)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | タンパク間相互作用 / タンパク定量 / タンパクの翻訳後修飾 / 質量分析 / 同位体解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内のタンパクは外的環境変化に対応して他のタンパクと複合体を形成する。その結合力には強弱があり、現在の生化学的技術ではそのタンパク間相互作用を検出できない事例が多々存在する。細胞内のタンパク間相互作用を検出するために、細胞内のタンパク因子群を架橋剤で固定し, さらにその複合体内の因子の存在比率を測定するためにSILAC (Stable Isotope Labeling of amino acid in cell culture) を組み合わせたSILAC-X-klinking-Protein purification-Mass spectrometry (SXP-MS)の開発を試みた。
(1) 出芽酵母を研究材料に、化学架橋剤であるDithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)で細胞を処理し、標的タンパクと結合する因子群の同定を行なった。
(2) 接触するタンパクのみを同定する方法として哺乳類培養細胞で開発されたBio-ID法を出芽酵母に導入した。
(2) SILAC法は異なる同位体でタンパクを標識した二細胞間の全タンパク量変動を比較できる方法であるが、取得する質量分析データが莫大で、比較したい標的タンパクに関するデータが埋没する可能性があった。本研究では二細胞から抽出したタンパクを等量混合し、SDS-poly acrylamide gel 電気泳動により目的タンパクを含むゲルバンドを単離し、ゲル内のタンパクを質量分析によって同定、安定同位体を使い存在比を比較した。本手法により二細胞間のタンパク量が正確に比較できる他、タンパク内の検出できる翻訳後修飾の存在比も比較できることが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
(1) 化学架橋剤で細胞をを処理し、標的タンパクおよび架橋剤処理で結合した結合タンパクの同定を試みた。その結果、架橋処理によるタンパク精製用の抗体が標的タンパクに結合できず、タンパクの精製量が架橋剤を未使用の場合よりも著しく減少した。さらに使用した化学架橋剤（DSP)の分子腕長が12オングストロームと長く、非常に多くのタンパクを架橋してしまった。そのため標的タンパクによって共沈するタンパク因子が多すぎる夾雑タンパクのために確認できなかった。さらに質量分析を使用して標的タンパク複合体の構成因子の同定を試みたが、高いm/zノイズシグナルのために、全くタンパクの同定に至らない問題が生じた。
(2) 接触するタンパクのみを同定する方法として哺乳類培養細胞で開発されたBio-ID法を出芽酵母に導入した。哺乳類細胞と違い、出芽酵母細胞では自らビオチン化されるタンパクが想定よりも多く、標的タンパクと相互作用する因子の同定は、タンパク量が多いものであれば同定できたが、非常に微量である場合タンパクの同定が難しいことが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 架橋剤の種類を変える。今回研究に使用したDSPは12オングストロームの長い架橋アームをもち、タンパク間の相互作用の有無に関係なく近至近距離にあるタンパク群を一括して結合させてしまう。DSPの代わりに4オングストロームの架橋アームを持つホルムアルデヒドもしくは7.72オングストロームのdisuccinimidyl glutarate (DSG)を使用することを計画している。
(2) BIO-ID法とSILAC法の組み合せを使用する。出芽酵母では内在性のビオチン化タンパクが非常に多いため、出芽酵母細胞抽出液を一旦ビオチン抗体ビーズで処理し内在性ビオチン化タンパクを除く。出芽酵母で発現し単離した大腸菌由来のビオチン化修飾酵素BirAとの融合した標的タンパクと細胞抽出液を混合し、ビオチン存在化で相互作用するタンパクをビオチン修飾を付加し、ビオチン抗体を使って精製、質量分析により網羅的に全結合タンパクを同定する。SILAC法を用いて、野生株および同定したタンパク因子をコードする遺伝子欠損株を異なった同位体で全タンパクを標識し、細胞内タンパクをそれぞれ等モル量ずつ混ぜ合わせた細胞抽出液を調製する。内在性ビオチン化タンパクを除いた後に、精製したBirA融合タンパクを加え、結合するタンパクを質量分析によって同定し、さらに異なった同位体に起因するMSシグナル比を計算することで、野生株および変異株間で標的タンパクとの複合体構成因子を比較する計画を進める。
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| Causes of Carryover |
(1) 化学架橋剤で細胞をを処理し、標的タンパクおよび架橋剤処理で結合した結合タンパクの同定を試みた。その結果、1. 架橋処理により標的タンパクの精製量が著しく減少した。2. 使用した化学架橋剤（DSP)の分子腕が長すぎたために、非常に多くの夾雑タンパクが混入した。3. 質量分析によるタンパク同定のための条件設定に時間が掛かりすぎた。これらの要因により新規に他の架橋剤などを購入することを行わなかったため。
(2) 哺乳類培養細胞で開発されたBio-ID法を出芽酵母に導入した。哺乳類細胞と違い、出芽酵母細胞では自らビオチン化されるタンパクが想定よりも多く、標的タンパクと相互作用する因子の同定は、タンパク量が多いものであれば同定できたが、非常に微量である場合タンパクの同定が難しく、この解決策を見いだすのに多くの時間を要し、新規のBIO-ID法に必要な試薬を等の購入を行なわなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
(1) 架橋剤の種類を変える。今回研究に使用したDSPは12オングストロームの長い架橋アームをもつが、DSPの代わりに短い架橋アームを持つホルムアルデヒドもしくはdisuccinimidyl glutarate (DSG)の購入に使用する予定。
(2) BIO-ID法の改良を試す。この計画では出芽酵母細胞抽出液を内在性ビオチン化タンパクを除くこと、ビオチン化修飾酵素BirAと融合した標的タンパクと細胞抽出液を精製する必要がある。そのため酵母抽出液からビオチン化タンパクを除くためのビオチン抗体ビーズと、ビオチン化修飾酵素BirAと融合した標的タンパクの精製に必要な精製キット類の試薬の購入に使用する予定。
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[Journal Article] Eudistomin C, an Antitumor and Antiviral Natural Product, Targets 40S Ribosome and Inhibits Protein Translation.2016
Author(s)
Ota Y, Chinen T, Yoshida K, Kudo S, Nagumo Y, Shiwa Y, Yamada R, Umihara H, Iwasaki K, Masumoto H, Yokoshima S, Yoshikawa H, Fukuyama T, Kobayashi J, Usui T
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Journal Title
Chembiochem : a European journal of chemical biology
Volume: 17
Pages: 1616-1620
DOI
Peer Reviewed
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