2016 Fiscal Year Research-status Report
In-organelle NMRによるミトコンドリア内蛋白質の動態解析
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15K14494
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (80261147)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
美川 務 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 専任研究員 (20321820)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / in-cell NMR / 蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，生体内の蛋白質の解析に対して潜在的なポテンシャルを持つin-cell NMR法を，真核細胞のオルガネラ内にある蛋白質の解析法として発展させることである．対象となるオルガネラとしては，細胞質と特に異なる環境を保持し，その単離方法も確立されているミトコンドリアを用いる．ミトコンドリア内環境が蛋白質の立体構造や動態（フォールディング安定性や高分子複合体との相互作用など）に与える影響を解析する．
蛋白質のオルガネラにおける機能発現のメカニズムは解析すべき重要な生命現象の一つである．一方で各オルガネラ内の物理化学的環境は充分に解明されていない．したがって，本研究の成果は，オルガネラにおける蛋白質の構造・活性相関を解析するためのブレークスルーになる可能性がある．
H28年度は，前年度に引き続き，既にin-cell NMR解析で実績がある連鎖球菌protein G B1ドメイン（GB1）および高度好熱菌T.thermophilus HB8 TTHA1718にミトコンドリア移行シグナル（MTS）を付加したものを用い，in-mitochondria NMRの手法の確立を進めた．使用するin-cell NMRの系としてはsf9/baculovirusの系とHeLa細胞の系を用い，sf9については細胞内の発現量の最適化，HeLa細胞の系では，細胞への導入効率の最適化とミトコンドリア試料の調製法の改良を行った．また，ミトコンドリアに加えて，核内のNMR観測を目指した研究も開始した．核に局在する，RNA結合活性を持つマルチドメイン蛋白質をモデル試料とし，各ドメインにC末端の核移行シグナルを結合させたフラグメントをデザインして，大腸菌を用いた発現系の作成を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミトコンドリア移行配列（MTS）を付加した蛋白質を，(1) Sf9内で安定同位体（13C/15N）標識培地中で発現させ，その後ミトコンドリアに移行させる方法，(2) 大腸菌内発現系で安定同位体標識させ，単離精製後にヒト培養細胞に導入し，その後ミトコンドリアに移行させる方法，の2つについては手法としてほぼ確立することに成功した．この結果，当初の計画書に記載した，マトリックス環境の物理的性質の解析，マトリックス環境が蛋白質のコンフォメーションやダイナミクスに与える影響の解析が可能になり，H28年度後半から実際に助走的研究を開始している．
また，in-organelle NMRの新しい展開として，（in-mitochondria NMRで得た知見を活かし）核内蛋白質の解析も開始している．
以上のように，本研究で目的としたin-organelle NMRの手法的基盤を確立させることができたこと，これを基に応用研究が進展しつつあること，また核内蛋白質を標的とした新しい展開の研究も進行していることから，おおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
H28までの研究によって，安定同位体標識させた標的蛋白質をミトコンドリア内に移行させ，詳細な動態をin-cell NMRによって観測する手法の確立に成功した．今後は，ミトコンドリア・マトリックス内での蛋白質を詳細にin-mitochondria NMRを用いて解析し，細胞質内の挙動，クラウダー分子存在下の挙動と比較することで，マトリックス環境の物理的性質の解析，マトリックス環境が蛋白質のコンフォメーションやダイナミクスに与える影響の解析を進めていく．また，当初の研究計画に従って，ミトコンドリア・マトリックス局在の蛋白質からマルチステップな選考基準によって，解析に適した試料を絞り込む作業も進行しているので，これらの蛋白質にも同様の実験を試みていく．
核内蛋白質の解析については，モデル蛋白質として選択した．RNA結合活性を持つマルチドメイン蛋白質の核内修飾の機序を解析対象とした．アミノ酸選択的13C/15N標識を行った様々な試料を核内に導入し，段階的に起こる修飾に由来するNMRシグナルの変化をモニターすることで，当該蛋白質の核内機能制御のメカニズムをin situ解析することを目指す．
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| Causes of Carryover |
H28年度は，物品費として700千円，旅費，人件費にそれぞれ100千円を計上していた．しかし，物品費は計画通りの支出をしたものの，研究報告用の旅費の支出が無かったこと，また研究の進捗に従って研究補助の必要が減じたことなどから，合計約183千円の次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は，H29年度の物品費と併せて使用する計画である．具体的には安定同位体標識化合物の購入に充てる．
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