2016 Fiscal Year Research-status Report
分泌顆粒局在型カルシウムチャネルORAI2による新たな分泌制御機構の解析
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15K14495
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鈴木 亮 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 講師 (00344458)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カルシウムチャネル / 開口放出 / マスト細胞 / アレルギー / 生物物理 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アレルギー疾患には、マスト細胞が重要な役割を担っており、抗原によってマスト細胞が活性化されると、分泌顆粒内の炎症性メディエータが放出され、アレルギー反応が惹起される。顆粒内炎症性メディエータの放出制御機構を明らかにすることは、アレルギー疾患の原因を追究する上で極めて重要であると考えられる。そのような中、我々は、多くの細胞で細胞膜に発現しているカルシウム遊離活性化Ca2+チャネル（ORAIファミリー）のサブタイプの１つであるORAI2が、マスト細胞においては分泌顆粒に局在し開口放出を制御していることを明らかにした。そこで本研究では分泌顆粒局在型Ca2+チャネルORAI2が制御する分泌メカニズムの解明を試みた。そこで、以下の項目について研究を実施した。（１）本研究の実施により作成に成功した分泌顆粒に局在するCa2+バイオセンサー（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors（SNARE）-GCaMPなど）を細胞内導入し一分泌顆粒レベルでの分泌顆粒内Ca2+動態を追究した。（２）分泌顆粒局在ORAI2が、顆粒の移動（トラフィッキング過程）を制御しているのか、その分子メカニズムを明らかにするため細胞骨格（Tubulin）と相互作用について追究した。（３）これまでの結果についてさらに詳細に分泌顆粒局在型Ca2+チャネルORAI2の機能を追究するため、これまでの研究で用いてきたORAI2ノックダウン細胞に加え、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いたORAI2ノックアウト細胞の樹立を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究成果から、分泌顆粒に局在するCa2+バイオセンサー（SNARE-GCaMPなど）を用いてイメージング解析を行った。その結果、一分泌顆粒レベルでの顆粒内Ca2+動態の解析に進展が得られた。しかし研究を進める過程で、移動する分泌顆粒のCa2+動態を正確に測定するためには、顆粒が移動する際の焦点面からのズレ等についても詳細に検討する必要性が生じた。そこでそのような問題点も考慮した分泌顆粒のCa2+動態の観察可能なシステムについても検討を行った。その結果、酸性顆粒を染色する蛍光指示薬を用い顆粒の蛍光強度も同時に測定することで、分泌顆粒の移動やズレに伴う詳細なCa2+動態の測定が可能になった。また、マスト細胞の刺激応答に伴う細胞骨格（Tubulin）と分泌顆粒局在型ORAI2の相互作用について追究したところ、刺激依存的に両者の相互作用が増強していることについて生化学的な解析にも成功した。さらに、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いたORAI2ノックアウト細胞の樹立に着手し、ORAI2を欠損した幾つかの有望な細胞株の樹立に成功し現在詳細な解析を行っているところである。そのため、現時点での進捗状況（到達状況）としては概ね良好と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、これまでの成果をさらに詳細に検討をしながら研究を実施する。そのため以下の項目について重点的に研究を遂行する。（１）これまで本研究により構築したオルガネラ局在型Ca2+バイオセンサー（分泌顆粒や小胞体）を用いて、Ca2+貯蔵オルガネラ（分泌顆粒、小胞体など）でのCa2+制御機構及びアレルギー制御機構を明らかにする。（２）分泌顆粒局在ORAI2が、顆粒トラフィッキングや膜融合をどのように制御しているのか、その分子メカニズムの解明を目指す。（３）脱顆粒反応（ヒスタミン分泌）だけでなく、顆粒局在型Ca2+チャネルORAI2が他の炎症性メディエータ（サイトカインやケモカイン）の細胞内Ca2+濃度調節を介した産生調節や分泌制御にどのように関与しているのか、その分子基盤を明らかにする。（４）また、上記の現象がヒトマスト細胞や動物レベルでどのように制御されているのか、これまで得られた知見を基に研究の一般化を目指す。
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| Causes of Carryover |
本年度の残予算については、イメージングを用いた基礎研究の多くを培養細胞で行ったため、比較的低予算でイメージング研究が遂行できたことに起因する。また、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムのノックアウト細胞の樹立のためのベクター作製、細胞への導入、細胞クローニングなどに多くの時間を要した。そのため、生化学的研究に用いる予定であった抗体の購入費用が予想以上に少なかったことが原因と考えられる。これまでの研究計画は概ね順調に進行しており、今後も本研究のさらなる展開が期待出来る。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画の最終年度である本年度は、分泌顆粒局在型ORAI2の機能を細胞・動物レベルで解析するための可視化解析のための動物購入費用や生化学的研究のための多種の抗体が必要となる。また、これまで培養細胞を中心に進めてきた研究をヒトマスト細胞やマウス初代培養マストへも研究を展開していく予定である。そのためその培養のための培地添加物（IL3、SCF、IL6など）など多額の費用を要する。それら購入費用として未執行予算を使用する計画である。
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