2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K14496
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
鈴木 宏明 中央大学, 理工学部, 准教授 (20372427)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 接着細胞 / ライブイメージング / 縦断面 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
接着性培養細胞のライブイメージングは，通常細胞がディッシュ底面上に二次元的に広がった状態で行われるため，培養面垂直方向の細胞内構造や動態を高解像度でとらえることが難しい．本研究では，簡単なマイクロ細胞培養デバイスを用い，細胞接着面を倒立顕微鏡ステージの垂直方向に配置することで，接着細胞の「縦断面」を時空間的に高解像度で簡便にイメージングする手法を開発する．
2015年度は，できるだけ簡便に，マイクロ流路の側面に接着細胞をコンフルエントに培養するための基礎的条件検討を行った．HeLa細胞をモデルに，培養時の流路角度を検討したところ，チップをほぼ垂直方向に向けて培養した際に細胞の集密度が最も高くなることを確認した．また，流路底面の厚さがカバーガラス厚となるデバイスを設計・製作することで，高倍率の油浸対物レンズにも対応可能となった．現在，ユーザーフレンドリーな（すなわち，誰が操作しても培養と高解像度の観察が可能な）デバイスおよびプロトコールの工夫を進めているところであり，2016年度には細胞の内部構造および内部輸送現象の蛍光観察という次のステップに進む予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実績の概要でも述べたように，PDMS製のオープン型流路内壁に細胞接着タンパク質をコーティングした後細胞懸濁液を導入し，その流路を垂直方向に立てた状態でインキュベーションを行うことで，流路側面に細胞を再現性良く培養するプロトコールをほぼ確立した．流路は，光造形装置を用いて作製した構造を鋳型とし，PDMSの型取りプロセスによって作製した．本デバイスを用い，蛍光共焦点顕微鏡で流路側面に付着した細胞を観察し，細胞膜，核，アクチン繊維の細胞縦断面蛍光観察像を取得することに成功した．流路側面においても，通常のディッシュ培養と同様のコンフルエントな培養条件が得られ，培養細胞を用いたバイオイメージングによる細胞アッセイを，細胞縦断面方向に対して行うための基盤技術が整いつつある．現在，培養プロトコール上の小さな問題点（PDMS製流路に付着する気泡の除去法の最適化，3Dプリンタによるインキュベーション時の流路チップ保持治具の製作など）を適宜解決しているところであり，2016年度前半には全プロトコールを完成させる予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
2016年度は，流路側壁面上への細胞培養プロトコールを完成させるとともに，高倍率油浸対物レンズを用いた高解像度細胞縦断面のデモンストレーションを行う．細胞内器官やファイバー構造等の蛍光ライブイメージングには，バキュロウィルスを用いた蛍光タンパク質融合タンパク質遺伝子のトランスフェクション試薬(Cell light, Thermo Scientific)を用いる．生きた細胞内で，小胞体やエンドソーム，リソソーム，細胞接着斑，アクチン繊維や微小管等の動態をとらえることが当面の目標である．同時に，細胞生物学者の研究協力者と相談し，生物学的によりインパクトのあるアプリケーションを探索し，最終年度に向けた準備を行う．
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| Causes of Carryover |
当初の計画では，縦断面計測のためのマイクロデバイスの仕様を完成後，大量生産のため外注する予定であった．しかし，外注先の会社の選定および交渉に時間がかかり，外注を2年目に行うことにした．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
マイクロデバイス大量生産のための外注を，2年目に行う．
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Research Products
(3 results)
