細胞質pH変化による細胞分化の光刺激人為制御

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14498
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 森本 雄祐 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (50631777)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: シグナル伝達 / 細胞内pH / 蛍光イメージング / 細胞分化 / 光遺伝学

Outline of Annual Research Achievements

細胞内pHは細胞の分化やシグナル伝達において、重要な要因の一つとして働いている。しかし、実際には細胞分化や発生における細胞内pHの詳細な役割は明らかではない。その大きな理由の一つが、生細胞における細胞内pHを高時空間分解能で経時的に計測および制御する技術が成熟してないためである。本研究課題では、オプトジェネティクスの応用による細胞内pHの光刺激制御によって、細胞性粘菌の細胞分化を人為制御することにより、分化の分子機構における細胞内pHの役割を明らかにすることを目指している。これまでに、新規に開発した高感度pHプローブを用いて、細胞性粘菌の分化に伴うダイナミックなpH変化を計測できている。また、細胞内pHの役割を明確にするために、発生過程においてcAMPやカルシウムイオンなどのセカンドメッセンジャーや分化マーカーと細胞質pHを高感度で同時計測することが可能になった。細胞性粘菌は発生にともなって、胞子と柄細胞の大きく２つに分化するが、柄細胞分化にともなって細胞質pHが低下することが１細胞レベルで測定できている。この結果を踏まえ、オプトジェネティクスで用いられるチャネルロドプシンなどの光操作ツールタンパク質を用いて細胞質pHを人為的に低下させる実験系の構築を目指している。しかし、これまでに光操作ツールタンパク質を効率よく細胞性粘菌の形質膜に局在発現する細胞株の構築に至っていない。効率的な実験系の確立のためにも、細胞株の構築を中心に研究を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新規に開発したpH感受性蛍光タンパク質を用いた計測により、細胞性粘菌の柄細胞分化に伴う細胞質pHの低下を１細胞レベルで高感度に計測することを達成している。発生・分化による細胞質pH低下の役割を明らかにするために、細胞質pHを人為的に制御するための実験系の確立を目指しているが、光操作ツールタンパク質を効率的に局在発現する細胞株の構築が達成できておらず、細胞質pHの操作までには至っていない。

Strategy for Future Research Activity

これまでに計測できている細胞分化に伴った細胞質pH変化について、より定量的な計測を行い、細胞分化におけるpH変化量を算出する。また、分化における細胞質pH低下の役割を明らかにするために、細胞性粘菌において光操作ツールタンパク質を効率的に発現する細胞株の構築を進めるとともに、阻害剤や弱酸などを用いた細胞質pHの人為操作実験系の導入も検討する。

Causes of Carryover

光操作等の実験系の確立が遅れているため、それらに使用予定だった試薬等の購入を保留したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

遅れている実験系の確立を進め、使用予定である。

Research Products

• [Journal Article] The bacterial flagellar type III export gate complex is a dual fuel engine that can use both H+ and Na+ for flagellar protein export (2016)
  • Author(s): Minamino T, Morimoto YV, Hara N, Aldridge PD, Namba K
  • Journal Title: PLoS Pathog Volume: 12 Pages: e1005495
  • DOI: doi: 10.1371/journal.ppat.1005495
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] FliH and FliI ensure efficient energy coupling of flagellar type III protein export in Salmonella. (2016)
  • Author(s): Minamino T, Kinoshita M, Inoue Y, Morimoto YV, Ihara K, Koya S, Hara N, Nishioka N, Kojima S, Homma M, Namba K
  • Journal Title: Microbiologyopen Volume: - Pages: in press
  • DOI: doi: 10.1002/mbo3.340
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] H+ and Na+ are involved in flagellar rotation of the spirochete Leptospira. (2015)
  • Author(s): Islam MS, Morimoto YV, Kudo S, Nakamura S
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 466 Pages: 196-200
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbrc.2015.09.004.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 自発的膜電位変化を伴う走化性シグナル伝達 (2016)
  • Author(s): 森本雄祐，上田昌宏
  • Organizer: 2016年 生体運動合同班会議
  • Place of Presentation: キャンパスプラザ京都（京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-01-09
• [Presentation] 細胞性粘菌におけるシグナル伝達と膜電位変化の関係 (2015)
  • Author(s): 森本雄祐，上田昌宏
  • Organizer: 第５回日本細胞性粘菌学会例会
  • Place of Presentation: 弘前大学（青森県弘前市）
  • Year and Date: 2015-10-11
• [Presentation] High-sensitivity fluorescence imaging of membrane potential in Dictyostelium (2015)
  • Author(s): 森本雄祐，上田昌宏
  • Organizer: 第５３回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-15
• [Presentation] 細胞内局所pHと細胞機能の関係 (2015)
  • Author(s): 森本雄祐，上田昌宏
  • Organizer: 分子研研究会「膜タンパク質内部のプロトン透過を考える」
  • Place of Presentation: 岡崎コンファレンスセンター（愛知県岡崎市）
  • Year and Date: 2015-04-20