2015 Fiscal Year Research-status Report
セパレースセンサーを用いた中心子複製ライセンシング機構の解明
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15K14508
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
花房 洋 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00345844)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | セパレース / セパレースセンサー / 中心小体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中心体は一対の母娘中心子（中心小体）からなり、細胞内の微小管形成中心として重要な働きをしている。中心子は細胞周期ごとに一度だけS期に複製される。中心子の複製が過剰に起こると中心体数の異常につながり、細胞分裂（M）期に染色体分配が不安定化することが知られている。このため中心子複製は厳密に制御されている。これまでの研究から、M期中期から後期にかけ母娘中心子が解離し、これがS期複製のライセンシングシグナルとして機能していることが明らかとなってきた。実際、母娘中心子解離が早まった細胞では、中心子複製が過剰に起きる。母娘中心子は、染色体同様コヒーシンによってタイトな結合が維持されており、プロテアーゼであるセパレースがコヒーシンを分解することで解離を引き起こすと考えられている。コヒーシンの切断配列の両側にGFP（緑色に発色）とmCherry（赤色に発色）の発色団を持ち、N末端に中心体局在ドメインであるPACTドメインを融合したセパレースセンサーを用いると、中心体特異的なセパレースの活性を、蛍光の変化で観察することができる。本研究ではこの系を用いて、中心子解離（ライセンシングシグナル）に重要な遺伝子の同定とその分子機構の解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでLRRK1を恒常的に活性化させると、母娘中心子の解離が早まり、中心体数が過剰になることを明らかにした。またLRRK1をノックダウンした細胞では、母娘中心子の解離が遅延する。このようにLRRK1はキナーゼ活性依存的に母娘中心子の解離を制御していることを明らかにした。さらにセパレースセンサーを用いて、LRRK1が中心体におけるセパレースの活性に重要か検討したところ、LRRK1をノックダウンした細胞でセパレースの活性が遅延するとの予備的結果を得た。現在、LRRK1の標的分子の探索、LRRK1の活性化機構について解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の点に焦点を絞り解析を行っていく予定である。
（１）LRRK1の下流で母娘中心子解離に機能する分子の同定
我々はLRRK1がキナーゼ活性依存的に母娘中心子の解離を制御していることを明らかにした。そこでLRRK1の標的分子の同定を行う。これまで予備的な実験から、LRRK1がダイニン結合分子NDE1及びNDEL1をリン酸化することを見出している。またこれらの分子を、siRNAを用いてノックダウンすると、母娘中心子の解離が影響を受けることもわかってきた。そこでLRRK1の下流でNDE1またはNDEL1が母娘中心子解離に機能していないか検討する。
（２）PP5によるLRRK1の脱リン酸化・不活性化の意義
セリンスレオニンフォスファターゼPP5は、LRRK1のキナーゼドメインに存在するスレオニンを脱リン酸化することで、LRRK1の活性を負に制御していることを見出した。興味深いことにPP5をノックダウンした細胞では、母娘中心子の解離が早まり、中心体数が過剰になる。そこでPP5がLRRK1の活性化を制御することで、母娘中心子解離を制御していないか検討する。
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